Ver el código de «Cristalografía de rayos X»

{{Artículo destacado}}
[[Archivo:Difraccion rayos x.png|miniatura|Proceso de determinación de la estructura de una molécula por cristalografía de rayos{{esd}}X.]]

La '''cristalografía de rayos{{esd}}X''' es una técnica experimental para el estudio y análisis de materiales, basada en el fenómeno de [[Difracción (física)|difracción]] de los [[rayos X]] por sólidos en estado [[cristal]]ino.

Los rayos{{esd}}X son difractados por los [[electrón|electrones]] que rodean los átomos por ser su [[longitud de onda]] del mismo orden de magnitud que el [[radio atómico]]. El haz de rayos{{esd}}X emergente tras esta interacción contiene información sobre la posición y tipo de átomos encontrados en su camino. Los cristales, gracias a su estructura periódica, [[Teoría de la dispersión|dispersan elásticamente]] los haces de rayos{{esd}}X en ciertas direcciones y los amplifican por [[interferencia constructiva]], originando un patrón de difracción.<ref group=n.>El término 'difracción de rayos{{esd}}X' se utiliza a menudo para referirse a la aplicación de este fenómeno a la cristalografía; sin embargo, es posible observar difracción por materiales no cristalinos. Por ejemplo, la estructura de la doble hélice de ADN se elucidó por primera vez usando datos de difracción de rayos{{esd}}X por fibras deshidratadas de ADN.</ref> Existen varios tipos de detectores especiales para observar y medir la intensidad y posición de los rayos{{esd}}X difractados, y su análisis posterior por medios matemáticos permite obtener una representación a escala atómica de los átomos y moléculas del material estudiado.

[[Max von Laue]] realizó los primeros experimentos de cristalografía de rayos{{esd}}X en 1912. Von Laue, [[William Henry Bragg]] y [[William Lawrence Bragg]] desarrollaron inicialmente la teoría de difracción de cristales, tarea a la que pronto se sumaron otros científicos. A lo largo del {{Siglo|XX||s}} tuvieron lugar varios avances teóricos y técnicos, como la aparición de los [[Supercomputadora|superordenadores]] y el uso de [[sincrotrón|sincrotrones]] para la producción de rayos{{esd}}X, que incrementaron la capacidad del método para determinar las propiedades estructurales de todo tipo de moléculas: [[sal (química)|sales]], materiales inorgánicos complejos, [[proteína]]s y hasta componentes celulares como los [[ribosoma]]s. Es posible trabajar con monocristales o con polvo microcristalino, consiguiéndose diferentes datos en ambos casos: para las aplicaciones que requieren solo una caracterización precisa de los parámetros de la red cristalina, puede ser suficiente la difracción de rayos{{esd}}X por polvo; para una dilucidación precisa de las posiciones atómicas es preferible trabajar con monocristales.

Dada la relación existente entre la estructura tridimensional de las moléculas y sus propiedades químicas y físicas, la cristalografía ha contribuido al avance en varias disciplinas científicas como la [[química]], la [[biología molecular]], la [[geología]], la [[física aplicada]] y la [[ciencia de materiales]]. La amplia disponibilidad de tubos de rayos{{esd}}X, complementada con el desarrollo de fuentes de rayos{{esd}}X de alta intensidad ha aumentado significativamente su impacto en estos campos de investigación así como en áreas con aplicaciones industriales, como el [[farmacología|desarrollo de fármacos]] y la [[mineralogía|mineralogía aplicada]]. La mayor limitación de este método es la necesidad de trabajar con sistemas cristalinos, por lo que no es aplicable a [[disolución|disoluciones]], a sistemas biológicos ''[[in vivo]]'', a [[sólido amorfo|sistemas amorfos]] o a [[gas]]es. En algunos casos, los rayos{{esd}}X pueden romper los [[enlace químico|enlaces químicos]] que mantienen la integridad estructural, lo que resulta en un modelo distorsionado de la molécula estudiada. Este problema afecta especialmente a los materiales de interés biológico.

== Historia ==
=== Primeros experimentos ===
{{Imagen múltiple
 | posición_tabla = left
 | dirección = vertical
 | ancho = 150
 | foto1 = Wh-bragg.jpg
 | foto2 = Wl-bragg.jpg
 | foto3 = Max von Laue 1914.jpg
 | texto   = Pioneros de la cristalografía de rayos X. De arriba abajo: William H. Bragg, su hijo William L. Bragg y Max von Laue.}}

La idea de que los [[cristal]]es son una repetición periódica de un grupo de [[molécula]]s ya existía anteriormente a que [[Wilhelm Röntgen|Wilhelm Conrad Röntgen]] descubriera los [[rayos X]] en 1895. Aunque las distancias típicas entre los planos de la red cristalina se desconocían, se sabía que debían ser muy pequeñas comparadas con la [[longitud de onda]] de la luz visible. Esto le dio al físico alemán [[Max von Laue]] la idea de utilizar cristales de [[sulfato de cobre (II)|sulfato de cobre]] para determinar si los rayos X se componían de partículas u ondas: dedujo que, si fueran ondas, deberían generar un patrón de [[Difracción (física)|difracción]] al atravesar los cristales.<ref group=n.>Esta cuestión fue resuelta definitivamente cuando [[Louis-Victor de Broglie|de Broglie]] introdujo en 1924 el concepto de la [[dualidad onda partícula]].</ref> Los experimentos se realizaron en 1912, con la ayuda de [[Walter Friedrich]] y [[Paul Knipping]], ambos antiguos estudiantes de Röntgen. Estos experimentos confirmaron la presencia de difracción cristalina, interpretada por von Laue como la extensión a tres dimensiones de la [[difracción de Fraunhofer]] por un enrejado.

Poco después, los británicos [[William Henry Bragg]] y [[William Lawrence Bragg]] (padre e hijo respectivamente) reprodujeron el experimento. W.L. Bragg explicó la difracción como la interferencia de los rayos X reflejados por planos cristalinos paralelos, introduciendo la descripción conocida desde entonces como la [[ley de Bragg]].<ref>{{cita publicación|apellidos=Bragg |nombre= William Lawrence Bragg|año = 1913 |publicación = Proc. Cambridge Philos. Soc.| volumen= 17|páginas= 43-57|idioma=inglés}}</ref> En 1913, [[Paul Ewald]] demostró que las dos interpretaciones de los resultados publicadas independientemente por von Laue y Bragg eran equivalentes.<ref>{{cita publicación|apellidos=Ewald |nombres= Paul Peter| año=1913|publicación= Phys. Z.|volumen= 14|páginas= 465-472}}</ref> Von Laue recibió el [[Anexo:Ganadores del Premio Nobel de Física|premio Nobel de Física]] en 1914 por su descubrimiento del fenómeno, y los Bragg recibieron el mismo premio un año más tarde por su trabajo en las aplicaciones prácticas.<ref group=n.>Debido al comienzo de la [[Primera Guerra Mundial]], en la que Suecia deseaba mantenerse estrictamente neutral y no dar la impresión de que se favorecía a ningún país contendiente, los premios no fueron otorgados hasta después de la guerra.</ref><ref>{{cita publicación|título=Disputed discovery: the beginnings of X-ray diffraction in crystals in 1912 and its repercussions|apellidos=Eckert|nombre=Michael| publicación=Acta Crystallographica A|año=2012|volumen=68|páginas=30-30|doi= 10.1107/S0108767311039985 | idioma=inglés}}</ref> Hacia el final de la década, se había logrado determinar las longitudes de onda de los rayos X y la estructura de varios compuestos inorgánicos simples y se habían establecido las bases teóricas de la técnica gracias al trabajo de los ya mencionados investigadores, [[Charles Galton Darwin]]<ref group=n.>Nieto de [[Charles Darwin]], autor de ''[[El origen de las especies]]''.</ref> y [[Peter Debye]], entre otros.

=== El desarrollo de la técnica: 1920-1960 ===
El período entre 1920 y 1960 se caracterizó por importantes adelantos metodológicos que propiciaron el empleo de la difracción de rayos X para analizar estructuras de moléculas más complejas.

Durante la década de 1920, los avances de la teoría cuántica sirvieron para caracterizar más precisamente la interacción entre los rayos X y los átomos de los cristales; esto posibilitó el análisis correcto de la intensidad de la difracción. En la misma época aparecieron las tablas para determinar la [[simetría cristalina]] a partir de la distribución de reflexiones en el patrón de difracción y se empezaron a usar las series de Fourier para representar la distribución de electrones en la red cristalina. Los desarrollos en la representación matemática de la densidad electrónica continuaron hasta la [[Segunda Guerra Mundial]], facilitando la obtención de las primeras estructuras de [[Compuesto orgánico|moléculas orgánicas]]. En 1935, el cristalógrafo británico [[Arthur Patterson]] descubrió un truco matemático para obtener las distancias interatómicas directamente a partir de los datos experimentales, lo que supuso un importante avance en el análisis de la difracción.<ref name=50years>{{cita libro|título= Fifty Years of X-Ray Diffraction| año=1962|editorial= International Union of Crystallography|autor= Bragg, William Lawrence; Ewald, Paul Peter (ed.)|capítulo=The growing power of X-ray analysis|páginas=120-135| idioma=inglés| url=http://www.iucr.org/__data/assets/pdf_file/0014/725/chap8.pdf| formato=PDF}}</ref>

Entre las décadas de 1940 y 1960, surgieron otros procedimientos para la determinación de estructuras, especialmente, [[heurística|métodos heurísticos]] basados en el proceso de [[ensayo y error]], que demostraron ser bastante exactos en combinación con restricciones condicionantes basadas en las propiedades físicas de una estructura correcta, como por ejemplo, que la densidad electrónica debe ser siempre positiva. En este período la cristalografía empezó a adquirir importancia en el campo de la [[química orgánica]], proceso que culminó con la determinación en 1957 de la estructura de la [[cianocobalamina|vitamina B12]], un proyecto liderado por [[Dorothy Crowfoot Hodgkin|Dorothy Hodgkin]].<ref name=50years />

=== Avances en cristalografía de macromoléculas: 1960-1980 ===
El adelanto más trascendente durante las décadas de los 60 y 70 fue el reconocimiento de la cristalografía de proteínas y de moléculas involucradas en procesos biológicos en general como área de investigación clave en la [[biología molecular]]. El año 1962 marcó un hito al otorgarse dos premios Nobel por los resultados obtenidos usando métodos cristalográficos en esta área: el [[premio Nobel de Química]] fue concedido a [[Max Perutz]] y [[John Kendrew]] por sus estudios cristalográficos de las proteínas [[hemoglobina]] y [[mioglobina]] y el [[Anexo:Ganadores del Premio Nobel de Fisiología o Medicina|premio Nobel de Medicina]] a [[Francis Crick]], [[James Dewey Watson|James Watson]] y [[Maurice Wilkins]] por descubrir que el [[Ácido desoxirribonucleico|ADN]] forma una doble hélice.{{Refn|1=[[Rosalind Franklin]], que realizó el análisis de los datos de difracción cruciales para determinar la estructura de la doble hélice, falleció antes de que se concediera el premio.<ref>{{cita publicación| publicación=Physics Today|título=Rosalind Franklin and the Double Helix|apellidos=Osman Elkin |nombre=Lynne|año=2003|| página=42 |volumen=56 |número=3|doi=10.1063/1.1570771|idioma=inglés}}</ref>|group=n.}} En 1964 Dorothy Hodgkin también obtuvo el premio Nobel de Química por la determinación de varias estructuras de importancia biológica, como la [[penicilina]] y la vitamina B12, entre otras.<ref name=nobels>{{Cita web|url=http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/lists/year/index.html|título=All Nobel Prizes by Year|editorial=The official web site for the Nobel Prize|idioma=inglés|fechaacceso=17 de enero de 2012}}</ref>

Un adelanto que facilitó en gran medida el éxito de las técnicas cristalográficas tanto en el caso de macromoléculas orgánicas con un gran número de átomos como en el de moléculas de menor tamaño fue el desarrollo de [[Computadora|ordenadores digitales]]; gracias a ellos fue posible usar programas para medir y analizar fácilmente los datos obtenidos en los experimentos en vez de realizar los laboriosos cálculos manualmente.<ref name="success-story">{{cita publicación|título=The success story of crystallography|apellidos=Schwarzenbach|nombre=Dieter| publicación=Acta Crystallographica A|año=2012|volumen=68|páginas=57-67|doi= 10.1107/S0108767311030303 | idioma=inglés}}</ref> Sin embargo, al final de este período el estudio de proteínas estaba aún limitado por la ausencia de fuentes de rayos X intensos y el empleo de [[película fotográfica]] para medir los patrones de difracción, lo que requería un largo proceso de [[Revelado fotográfico|revelado]] y [[Conversión analógica-digital|digitalización]] de las imágenes.<ref group=n.>La medición individual de reflexiones de rayos X emergentes en diferentes direcciones con un [[fotodetector]] unidimensional, que facilitó la automatización de los experimentos con moléculas pequeñas durante este periodo no resultaba práctica en el caso de moléculas con muchos átomos, debido a la enorme cantidad de reflexiones presentes en este caso.</ref> A consecuencia de estas limitaciones, y a pesar del reconocimiento generalizado del potencial de la cristalografía para estos experimentos, a finales de la década de 1970 el [[Protein Data Bank|Banco de Datos de Proteínas]] solo contaba con unas sesenta entradas.<ref name=pdb>{{Cita web|url=http://www.rcsb.org/pdb/statistics/contentGrowthChart.do?content=explMethod-xray&seqid=100|título=Yearly growth of structures solved by X-ray|editorial=RCSB Protein Data Bank|idioma=inglés|fechaacceso=6 de octubre de 2016|urlarchivo=https://web.archive.org/web/20161009134526/http://www.rcsb.org/pdb/statistics/contentGrowthChart.do?content=explMethod-xray&seqid=100|fechaarchivo=9 de octubre de 2016}}</ref>

=== Expansión y madurez: 1980-2010 ===
{{Imagen múltiple
 | posición_tabla = right
 | dirección = horizontal
 | ancho1 = 200
 | foto1 = 50S-subunit of the ribosome 3CC2.png
 |ancho2= 60
 | foto2 = PDB 2spo EBI.jpg
 | texto   = Modelo cristalográfico de la subunidad mayor del [[ribosoma]]. La obtención de esta estructura, galardonada con el [[premio Nobel de Química]] en 2009, fue posible gracias a los avances tecnológicos y metodológicos de los años 1980 y 1990. Como comparación, a la derecha y aproximadamente en la misma escala, se muestra el modelo de la [[mioglobina]], una de las primeras proteínas estudiadas con esta técnica durante los años 1950 y cuya determinación se consideró un logro considerable en esa época.}}
Los [[tubo de rayos X]], con sucesivas mejoras, se utilizaron como la fuente primordial de rayos{{esd}}X para los experimentos de cristalografía desde sus comienzos hasta la década de 1970, época en la que se empezó a experimentar con la [[radiación de sincrotrón]] de rayos{{esd}}X. Los [[Sincrotrón|sincrotrones]] dedicados exclusivamente a la producción de rayos{{esd}}X aparecieron en la década de 1980 y su número no ha dejado de aumentar desde entonces.<ref group=n.>Véase la lista en [[Anexo:Fuentes de luz sincrotrón]].</ref> En la primera década del {{Siglo|XXI||s}} se construyeron los primeros [[láser de electrones libres|láseres de electrones libres de rayos-X]], capaces de producir haces de luz pulsada de una intensidad de órdenes de magnitud mayor que en las fuentes de luz sincrotrón convencionales. La duración de los pulsos de luz, del orden de [[femtosegundo]]s ofrece la posibilidad de observar cambios en los cristales a escalas temporales inalcanzables anteriormente.<ref name="success-story" /> Durante estos años también se desarrollaron nuevos detectores bidimensionales o «de área», capaces de generar directamente una imagen digitalizada del patrón de difracción. Estos detectores facilitaron la rápida medición y análisis de la difracción y sustituyeron totalmente a las [[película fotográfica|placas fotográficas]] usadas hasta entonces.

Los mencionados avances, unidos al incremento de la capacidad de los ordenadores modernos para almacenar y procesar datos, han permitido llevar a cabo experimentos antaño irrealizables, y han desembocado en un aumento exponencial del número de estructuras elucidadas por métodos cristalográficos. El desarrollo más notable ha tenido lugar en el área de las macromoléculas orgánicas, con más de 88&nbsp;000 estructuras depositadas en el Banco de Datos de Proteínas al comienzo de 2013.<ref name=pdb /> La obtención en 2000 de la estructura del [[ribosoma]],<ref>{{cita publicación|publicación=Current Opinion in Structural Biology|título=Atomic structures at last: the ribosome in 2000|apellidos=Ramakrishnan|nombre=Venki|apellidos2=Moore|nombre2=Peter B.|año=2001|volumen=11|páginas=144-154|formato=PDF|url=http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/ribo/homepage/pdf/ramakrishnan_moore_curropin2001.pdf|fechaacceso=20 de enero de 2012|urlarchivo=https://web.archive.org/web/20130201121157/http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/ribo/homepage/pdf/ramakrishnan_moore_curropin2001.pdf|fechaarchivo=1 de febrero de 2013}}</ref> un enorme complejo de [[ácido nucleico|ácidos nucleicos]] y varias proteínas donde tiene lugar la síntesis de proteínas en la [[célula]], ilustra las capacidades que ha alcanzado la técnica.

== Aspectos físicos ==
=== Cristales y redes cristalinas ===
[[Archivo:DCl Neutron powder.png|miniatura|izquierda|Estructura cristalina de
[[cloruro de hidrógeno]] [[deuterio|deuterado]] con la celda unidad superpuesta
sobre las moléculas. La red cristalina se forma mediante la
translación de la celda unidad a lo largo de las direcciones definidas
por <math>a, b</math> y <math>c</math>.]]
[[Archivo:Orthorhombique.png|miniatura|Parámetros de la celda unidad.]]
{{AP|Celda unidad|Redes de Bravais}}

Los cristales están formados por una repetición periódica de moléculas
en tres dimensiones. El cristal se puede representar matemáticamente
como una [[Redes de Bravais|red tridimensional]], llamada «red de Bravais», en la que todas las
intersecciones, o nodos, son idénticas.<ref>{{Cita web|url=http://www.doitpoms.ac.uk/tlplib/crystallography3/lattice.php|título=Lattices|autor=Universidad de Cambridge|enlaceautor=Universidad de Cambridge|fechaacceso=22 de marzo de 2012|idioma=inglés}}</ref>{{Harvnp|Stout|Jensen|1989|pp=18-19}} El [[paralelepípedo]] definido por las líneas entre distintos nodos de la red se conoce como la [[celda unidad]]; aunque para una red dada sea posible designar múltiples celdas unidad que cumplan esta definición, por convención se escoge habitualmente la de menor volumen que refleje la simetría del cristal.<ref>{{Cita web|url=http://www.doitpoms.ac.uk/tlplib/crystallography3/unit_cell.php|título=Unit cell|autor=Universidad de Cambridge|enlaceautor=Universidad de Cambridge|fechaacceso=22 de marzo de 2012|idioma=inglés}}</ref>{{Harvnp|Stout|Jensen|1989|pp=18-19}} La celda unidad se define por la longitud de sus lados <math>a</math>, <math>b</math> y <math>c</math> en la dirección de los tres ejes espaciales y los ángulos <math>\alpha</math>, <math>\beta</math> y <math>\gamma</math> que los ejes de la red forman entre sí. Las coordenadas de cualquier punto de la red cristalina se pueden expresar como una [[combinación lineal]] de los vectores <math>\mathbf a</math>, <math>\mathbf b</math> y <math>\mathbf c</math>.<ref>{{Cita web|url=http://www.doitpoms.ac.uk/tlplib/crystallography3/parameters.php|título=Lattice geometry|autor=Universidad de Cambridge|enlaceautor=Universidad de Cambridge|fechaacceso=22 de marzo de 2012|idioma=inglés}}</ref>

La posición de un átomo en la celda unidad se expresa como [[coordenadas fraccionarias]] de <math>\mathbf a</math>, <math>\mathbf b</math> y <math>\mathbf c</math> de la siguiente forma:

:<math>R = x \mathbf a + y \mathbf b + z \mathbf c</math>

con las coordenadas (<math>x</math>, <math>y</math>, <math>z</math>) comprendidas entre 0 y 1.{{Harvnp |Drenth|1999|p=62}}

El objetivo de los experimentos de difracción por rayos X es averiguar <math>x</math>, <math>y</math> y <math>z</math> para cada átomo. Para lograrlo es necesario, en primer lugar, determinar la relación entre la red cristalina y la geometría del patrón de difracción y, en segundo lugar, obtener las posiciones de los átomos a partir de la intensidad de la difracción.

=== Rayos X ===
{{AP|Rayos X}}

[[Archivo:OndaElectromagnetica.svg|miniatura|Representación esquemática de una [[onda electromagnética]], mostrando la oscilación periódica de los campos [[campo eléctrico|eléctrico]] y [[campo magnético|magnético]].]]
Los rayos{{esd}}X son un tipo de [[radiación electromagnética]] con longitudes
de onda entre 10 y {{nowrap|10<sup>-2</sup> [[nanómetro|nm]]}} o energías entre 0,1 y
{{nowrap|100 [[electronvoltio|keV]]}}.{{Harvnp|Stout|Jensen|1989|p=7}} Para los experimentos de difracción cristalina se suelen usar rayos{{esd}}X de energía relativamente alta, del orden de {{nowrap|10 keV}}, correspondiente a longitudes de onda del orden de {{nowrap|0,1 nm}}.{{Harvnp|Stout|Jensen|1989|p=11}}{{Harvnp|Helliwell|1992|pp=268-274}}

Los rayos{{esd}}X se describen matemáticamente como una [[Radiación electromagnética|onda sinusoidal]] propagándose a través del espacio.

Tomando un punto arbitrario como origen, el valor del campo eléctrico <math>E</math> en función del tiempo
<math>t</math> se puede escribir como:{{Harvnp |Drenth|1999|pp=71-74}}<ref name=cambridge>{{Cita web|url=http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/Course/Adv_diff1/Diffraction.html|título=Advanced diffraction: waves, interference and complex numbers|autor=Read,Randy|año=2009|fechaacceso=26 de marzo de 2012|idioma=inglés|obra=Protein Crystallography Course|editorial=[[Universidad de Cambridge]]}}</ref>

:<math>E(t) = A \exp (2\pi i c t/\lambda) </math>

<math>A</math> es la amplitud de la oscilación, <math>\lambda</math>
la longitud de onda y <math>c</math> la [[velocidad de la luz]]. A consecuencia de la interacción con los electrones de los átomos en la muestra, la onda sufre un desfase <math>\alpha</math> con respecto a la onda en el punto de origen:

:<math>E(t) = A \exp (2\pi i c t/\lambda)  \exp (2\pi i \alpha)</math>

La diferencia de fase depende de la distancia entre el punto de origen y los átomos del material; esto implica que la estructura atómica, es decir, las posiciones que ocupan los átomos, se pueden derivar de la fase de los rayos{{esd}}X que han atravesado el material.

=== Dispersión elástica de rayos X ===
{{VT|Factor de forma atómica|factor de estructura}}

El fenómeno de difracción cristalina tiene su origen en la [[Teoría de la dispersión|dispersión elástica]] o ''scattering'' elástico del haz de rayos X por los átomos del cristal.<ref group=n.>Desde el punto de vista de la [[electrodinámica cuántica]], la dispersión elástica es simplemente un caso especial del [[efecto Compton]].</ref> En este tipo de [[interacción electromagnética|interacción]], el electrón desvía los rayos X, que toman exactamente la misma trayectoria que un rayo de luz visible reflejado en un espejo, es decir, los
rayos dispersados emergen a un ángulo <math>2 \theta</math> con respecto a la dirección de los rayos incidentes.<ref group="n."><math>\theta</math> es el ángulo de incidencia respecto al plano de reflexión.</ref> Tanto el electrón como los rayos X conservan su energía inicial durante esta interacción.{{Harvnp|Drenth|1999|p=75}}

La dispersión elástica por un grupo de átomos en una dirección dada se puede cuantificar con una cantidad conocida como [[factor de estructura]] que es igual a la suma de los rayos reflejados por cada átomo <math>j</math> que interactúa con los rayos incidentes<ref group=n.>El factor de estructura es una función compleja, representada habitualmente como un vector en el [[plano complejo|plano de Argand]]. Por este motivo, varios autores usan la nomenclatura vectorial utilizada aquí.</ref>{{Harvnp|Drenth|1999|p=88}}

:<math>\mathbf F(\mathbf S)= \sum\limits_{j} f_{j} \exp(2 \pi i \mathbf r_{j} \cdot \mathbf S)</math>

<math>f</math> es una función llamada [[factor de forma atómica]] —o factor de dispersión atómica— que describe la dispersión por todos los electrones del átomo en conjunto. La dispersión elástica atómica depende del [[número atómico]] <math>Z</math> y del ángulo de incidencia de los rayos X.<ref>{{Cita web|url=http://materias.fi.uba.ar/6210/Difracci%C3%B3n%20de%20rayos%20X-1%20doc.pdf|formato=PDF|título=Aplicaciones de la difracción de rayos X|autor=Ozols,Andrés|editorial=Facultad de Ingeniería, [[Universidad de Buenos Aires]]|año=2009|fechaacceso=26 de marzo de 2012|fechaarchivo=6 de marzo de 2010|urlarchivo=https://web.archive.org/web/20100306143936/http://materias.fi.uba.ar/6210/Difracci%C3%B3n%20de%20rayos%20X-1%20doc.pdf|deadurl=yes}}</ref> El cambio de fase de los rayos dispersados durante la interacción viene dado por el producto escalar de <math>\mathbf r_{j}</math>, el vector entre el origen y cada átomo <math>j</math> y <math>\mathbf S</math>, conocido como vector de dispersión, con magnitud <math>2 \sin \theta/\lambda</math> y dirección perpendicular al plano virtual de reflexión.

=== Difracción cristalina ===
{{Imagen múltiple
 | posición_tabla = left
 | dirección = vertical
 | ancho = 150
 | foto1 = Phasenverschiebung 20 Grad.PNG
 | foto2 = Phasenverschiebung 180 Grad.PNG
 | texto   = Adición de ondas: cuando las ondas están desfasadas, se
 aniquilan mutuamente; cuando están en fase, se amplifican.}}

==== Ley de Bragg ====
{{AP|Ley de Bragg}}
La difracción en una dirección dada se debe esencialmente a la relación entre las fases de todas las ondas reflejadas por cada celda unidad del cristal en esa dirección. Los rayos que han atravesado distintos puntos del cristal siguen [[camino óptico|caminos ópticos]] de diferente longitud y esta diferencia da lugar a un cambio en la amplitud de la onda resultante; cuando la diferencia de fase es de 180 grados, las ondas se anulan entre sí. Por el contrario, cuando las ondas están en fase, la amplitud de la onda final es la suma de las amplitudes para cada onda. Puesto que un cristal está compuesto de un gran número celdas unidad, la interferencia constructiva entre todas ellas resulta en un haz lo suficientemente intenso para poder ser medido con un detector de rayos X.
[[Archivo:Loi de bragg.png|miniatura |Ley de Bragg: Los átomos o grupos de átomos en la [[red de Bravais|red cristalina]] están representados por esferas (para simplificar el diagrama, la tercera dimensión del cristal no se representa). Las esferas se sitúan sobre planos imaginarios paralelos, perpendiculares al diagrama, separados por <math>d</math>. Los rayos X inciden sobre los planos a un ángulo <math>\theta</math>. En la imagen de la izquierda, la diferencia en el [[camino óptico|camino]] recorrido por las ondas dispersadas por los dos planos es un múltiplo entero de la [[longitud de onda]]; por lo tanto, las ondas emergentes están en fase y se observa difracción a un ángulo <math>\theta</math> respecto de los planos de difracción o <math>2\theta</math> respecto al haz incidente. A la derecha, con un [[ángulo de incidencia]] diferente, la Ley de Bragg no se cumple para esta familia de planos cristalinos; las ondas emergentes están desfasadas y no se observa difracción.]]
La condición para que las ondas estén en fase es que la diferencia de sus caminos ópticos sea cero o un [[número entero|múltiplo entero]] <math>n</math> de la longitud de onda. En un cristal, la diferencia en el camino óptico entre átomos situados en posiciones equivalentes en distintas celdas unidad es <math>2 d \sin \theta</math> donde <math>d</math> es la distancia entre los planos imaginarios que unen los puntos equivalentes de la red cristalina. Es decir, para que se observe interferencia constructiva de rayos X a un ángulo de observación <math>2\theta</math>, se debe cumplir la expresión conocida como Ley de Bragg:<ref>{{Cita web|url=https://dictionary.iucr.org/Bragg%27s_law|título=Bragg's law|obra=Online dictionary of crystallography|autor=IUCr|enlaceautor=Unión Internacional de Cristalografía|fechaacceso=29 de marzo de 2012|fecha=3 de febrero de 2012|idioma=inglés}}</ref>

:<math>n \lambda = 2 d \sin \theta </math>

Como en el caso de la dispersión elástica por un átomo, la difracción cristalina se puede interpretar como la reflexión especular de los rayos X por todos los planos del cristal a un ángulo <math>\theta</math> del haz incidente y separados entre sí por la distancia <math>d</math> que cumple la ley de Bragg. Por este motivo, los puntos del patrón de difracción se denominan «reflexiones».<ref name=uned-lb>{{Cita web|url=http://www.uned.es/cristamine/cristal/drx_mrc.htm|título=Ecuaciones de Laue. Ley de Bragg|editorial=Universidad Nacional de Educación a Distancia, Facultad de Ciencias|obra=Curso de cristalografía estructural|fechaacceso=29 de marzo de 2012|fechaarchivo=29 de octubre de 2015|urlarchivo=https://web.archive.org/web/20151029143133/http://www.uned.es/cristamine/cristal/drx_mrc.htm|deadurl=yes}}</ref>

[[Archivo:Miller Indices Felix Kling.svg|miniatura|izquierda|Índices de Miller: La figura muestra ejemplos de diferentes planos de difracción en una [[celda unidad]], ilustrando la correspondencia entre los índices de Miller <math>{hkl}</math> y la orientación de los planos en el sistema de coordinadas definido por aquella.]]

==== Índices de Miller ====
{{AP|Índice de Miller}}

Para que se cumpla la ley de Bragg para un grupo de planos de reflexión paralelos, estos deben cruzar los ejes de la celda unidad un número entero de veces. Las reflexiones cristalinas se identifican mediante tres números <math>h</math>, <math>k</math> y <math>l</math> iguales al número de intersecciones de los planos con los ejes
<math>a</math>, <math>b</math> y <math>c</math> de la celda. Los números <math>h</math>, <math>k</math> y <math>l</math>
reciben el nombre de índices de Miller. Matemáticamente, los índices de Miller describen un vector perpendicular al plano de reflexión en el sistema de coordenadas definido por la red cristalina.<ref name=mi>{{Cita web|url=https://dictionary.iucr.org/Miller_indices|título=Miller indices|obra=Online dictionary of crystallography|autor=IUCr|enlaceautor=Unión Internacional de Cristalografía|fechaacceso=3 de abril de 2012|fecha=6 de febrero de 2012|idioma=inglés}}</ref>

==== La red recíproca ====
{{AP|Red recíproca}}

Se denomina red recíproca a la [[transformada de Fourier]] de la red cristalina. Esta construcción matemática facilita la
representación de los planos de reflexión y la visualización
de la relación entre la orientación del cristal y el patrón de
difracción. Las coordenadas de cada punto de la red recíproca coinciden con los
índices de Miller, es decir, cada punto de la red recíproca representa a una
familia de planos de Miller en el espacio real de la red cristalina; la
distancia del origen a cada punto de la red es <math>1/d</math>.<ref name=rl>{{Cita web|url=https://dictionary.iucr.org/Reciprocal_lattice|título=Reciprocal lattice|obra=Online dictionary of crystallography|autor=IUCr|enlaceautor=Unión Internacional de Cristalografía|fechaacceso=29 de marzo de 2012|fecha=25 de mayo de 2007|idioma=inglés}}</ref>{{Harvnp|Stout|Jensen|pp=26-33}}

Al igual que en el caso de la red cristalina, los
puntos de la red recíproca se pueden expresar como una combinación
lineal de vectores  <math>\mathbf a^{\ast}</math>, <math>\mathbf b^{\ast}</math> y
<math>\mathbf c^{\ast}</math>:<ref name=rl />

:<math>
\mathbf O\mathbf H = h\mathbf a^{\ast} + k\mathbf b^{\ast} + l\mathbf c^{\ast}
</math>

La relación entre los parámetros de la celda unidad (<math>a</math>, <math>b</math>, <math>c</math>, <math>\alpha</math>, <math>\beta</math>, <math>\gamma</math>) de volumen <math>V</math> y la celda unidad recíproca (<math>a^{\ast}</math>, <math>b^{\ast}</math>, <math>c^{\ast}</math>,
<math>\alpha^{\ast}</math>,<math> \beta^{\ast}</math>, <math>\gamma^{\ast}</math>) es la siguiente:<ref>{{cita libro|capítulo=Reciprocal lattice|autor=Authier, André|editorial=University College Cardiff Press, Cardiff, Wales; Versión digital: [[Unión Internacional de Cristalografía]] |año-original=1981| isbn=0 906449 08 1|título=Teaching pamphlets|url=http://www.iucr.org/__data/assets/pdf_file/0017/13193/4.pdf|formato=pdf| fechaacceso = 11 de febrero de 2012|idioma=inglés}}</ref>{{Harvnp|Stout|Jensen|pp=26-33}}

:<math>a^{\ast} = \frac{ bc\sin\alpha}{V} ; b^{\ast} = \frac{ac\sin\beta}{V} ; c^{\ast} = \frac{ab\sin\gamma}{V}</math>

:<math>V^{\ast} = a^{\ast}b^{\ast}c^{\ast} \sqrt{1 -\cos^2 \alpha^{\ast} -\cos^2 \beta^{\ast} - \cos^2 \gamma^{\ast} + 2\cos \alpha^{\ast}\cos\beta^{\ast}\cos\gamma^{\ast}}</math>

:<math>\cos\alpha^{\ast} = \frac{\cos \beta\cos\gamma - \cos\alpha}{\sin\beta\sin\gamma} ; \cos\beta^{\ast} = \frac{\cos \alpha\cos\gamma - \cos\beta}{\sin\alpha\sin\gamma} ; \cos\gamma^{\ast} = \frac{\cos \alpha\cos\beta - \cos\gamma}{\sin\alpha\sin\beta}</math>

[[Archivo:Ewald.gif|miniatura|Representación bidimensional de la construcción de
Ewald. Los rayos X incidentes están representados por el vector de
onda <math>\mathbf K_{i}</math>, de amplitud <math>1/\lambda</math>. La red
recíproca se representa en azul; para simplificar el diagrama, solo se muestran las
coordenadas de algunos puntos de la red, representando a los planos de Miller
correspondientes. El punto (4,1) coincide con la superficie de la
esfera, por lo tanto se observará un haz de rayos X con el [[vector de onda]] <math>\mathbf K_{f}</math> reflejado en la
dirección dada por <math>2\theta</math>. La magnitud del vector diferencia entre
<math>\mathbf K_{i}</math> y <math>\mathbf K_{f}</math> o vector de difracción es la distancia entre los
planos paralelos de índices (4,1).]]

==== La esfera de Ewald ====
{{AP|Esfera de Ewald}}

Para visualizar fácilmente los planos de Miller que contribuyen a la
difracción en una dirección dada y determinar la relación entre la orientación del cristal y el patrón de difracción, se utiliza la construcción conocida
como [[esfera de Ewald]]. La esfera de Ewald ilustra todas las posibles
direcciones en que los rayos X pueden ser reflejados por el
cristal. El radio de esta esfera es <math>1/\lambda</math> y su extremo
en la dirección del haz de rayos X incidente coincide con el origen de
la red recíproca.<ref name=uned-lb /><ref name=rl />

Si un punto de la red recíproca de coordenadas
<math>(h,k,l)</math> se encuentra sobre
la superficie de la esfera de Ewald, los planos de Miller con índices
<math>(h,k,l)</math> darán lugar a un punto de difracción en la
dirección definida por el centro de la esfera y ese punto de la red
recíproca. La distancia entre el origen y <math>(h,k,l)</math> es
<math>1/d</math>, por lo que se puede demostrar geométricamente que
esta condición de difracción es equivalente a la ley de Bragg.<ref name=rl />

==== El factor de estructura cristalino ====
{{AP|factor de estructura}}

El vector con coordenadas <math>(h,k,l)</math> en la red recíproca es
perpendicular al plano de reflexión y su magnitud es
<math>1/d = 2\sin\theta/\lambda</math>; es decir, es un vector de dispersión
<math>\mathbf S</math>, introducido en la definición del
factor de estructura <math>\mathbf F(\mathbf S)</math>, para el que se cumple la ley de Bragg. Por lo tanto, el factor de estructura en la dirección definida por los planos de Miller descritos por los índices <math>(h,k,l)</math> se reformula como<ref name=fs>{{Cita web|url=https://dictionary.iucr.org/Structure_factor|título=Structure factor|obra=Online dictionary of crystallography|autor=IUCr|enlaceautor=Unión Internacional de Cristalografía|fechaacceso=9 de abril de 2012|fecha=1 de septiembre de 2011|idioma=inglés}}</ref><ref group="n.">La nomenclatura usada para designar al factor de forma cristalino varía; a menudo aparece como   <math>\mathbf F(hkl)</math>. Otras denominaciones comunes son <math>\mathbf F(\mathbf h)</math>, <math>\mathbf F(\mathbf S)</math> y <math>\mathbf F(\mathbf Q)</math>. Las dos últimas son más utilizadas para describir la difracción en general que en el caso específico de la difracción cristalina.</ref>

:<math>\mathbf F_{hkl} = \sum\limits_{j} f_{j}\exp(2\pi i \mathbf r_{j}\cdot\mathbf S) = \sum\limits_{j} f_{j}\exp(2\pi i(x_{j}h+y_{j}k+z_{j}l))
</math>

donde <math>(x,y,z)</math> es el vector de coordenadas del átomo <math>j</math> en el sistema definido por la celda unidad y la suma se realiza para todos los átomos contenidos en ella. En lugar de sumar las contribuciones de cada átomo, también se puede realizar una integración sobre los electrones en el volumen <math>V</math> de la celda unidad, cuya distribución por elemento de volumen se representa por la función de [[densidad electrónica]] {{nowrap|<math>\rho(x,y,z)</math>:}}{{Harvnp|Stout|jensen|1989|p=205}}

:<math>\mathbf F_{hkl} = \int_{x}\int_{y}\int_{z} \rho(x,y,z)\exp(2\pi i(xh+yk+zl)) dz dy dx</math>
[[Archivo:Friedel's law.svg|izquierda|miniatura|Representación vectorial de la Ley de Friedel en la ausencia de absorción. Las magnitudes de los factores de estructura relacionados por esta ley, conocidos como «pares Friedel» son iguales, y sus fases, opuestas.]]
La aplicación de las [[Grupo de simetría|operaciones de simetría del cristal]] a las coordenadas <math>(x,y,z)</math> resulta en relaciones de igualdad entre los factores de estructura de diferentes reflexiones. A las reflexiones así relacionadas se las denomina «simétricamente equivalentes». En los experimentos cristalográficos, donde el grupo de simetría no se conoce con certeza ''a priori'', se comparan las reflexiones relacionadas por diversas operaciones de simetría para caracterizar la simetría del cristal. La igualdad entre los módulos o «amplitudes» de las reflexiones relacionadas por un centro de inversión, con índices de Miller <math>(h,k,l)</math> y <math>(-h,-k,-l)</math>

:<math>|\mathbf F_{hkl}| = |\mathbf F_{\bar{h}\bar{k}\bar{l}}|</math>

se conoce como [[ley de Friedel]] y ocurre incluso en la ausencia de simetría, aparte de la traslación de la celda unidad sobre la red cristalina.{{Harvnp|Stout|Jensen|1989|p=203}} En la práctica la ley de Friedel no se cumple exactamente debido a la presencia de [[Teoría de la dispersión|interacciones inelásticas]] entre los rayos X y los átomos, que resultan en absorción de energía por estos.<ref>{{Cita web|url=https://dictionary.iucr.org/Friedel%27s_law|título=Friedel's law|obra=Online Dictionary of Crystallography|autor=Unión Internacional de Cristalografía|enlaceautor=Unión Internacional de Cristalografía|idioma=inglés|fechaacceso=12 de marzo de 2012}}</ref> Esos efectos suelen ser pequeños comparados con las interacciones elásticas y no se suelen tener en cuenta, excepto para longitudes de onda en la vecindad de una discontinuidad de [[Absorción (óptica)|absorción]] del cristal.

== El problema de las fases ==
El propósito de los experimentos cristalográficos no es obtener el patrón de difracción, sino el valor de la función de distribución electrónica <math>\rho(x,y,z)</math>, lo que permite determinar la posición de los átomos y la estructura tridimiensional de la molécula cristalina. Se puede demostrar que <math>\rho(x,y,z)</math> puede representarse como [[Serie de Fourier|sumas de Fourier]] de los factores de estructura en todas las direcciones:{{Harvnp|Stout|Jensen|año=1989|p=209}}

<math>\rho(x,y,z) = \frac{1}{V}\sum\limits_{h} \sum\limits_{k} \sum\limits_{l} |\mathbf F_{hkl}|\exp( -2\pi i(xh+yk+zl)) </math>

Mientras que el módulo del factor de estructura es simplemente la raíz cuadrada de la intensidad del punto de difracción, medida por un detector sensible a los rayos{{esd}}X, la fase no se puede computar directamente. Esto se conoce como el «problema de las fases».<ref>{{cita libro|autor= Elies Molins y Joan F. Piniella |capítulo= Determinación y aplicación de las densidades electrónicas precisas|título=Cristalografía|volumen=26|serie=Colección:Nuevas Tendencias|páginas=61-62|editor=Félix Hernández Cano, Concepción Foces-Foces, Martín Martínez-Ripoll|editorial= [[Consejo Superior de Investigaciones Científicas|CSIC]]|año= 1995 |isbn=8400075579}}</ref> Existen varios métodos para resolver el problema de las fases y elucidar la estructura atómica, clasificados en los siguientes grupos:<ref>{{Cita web|url=http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/Course/Basic_phasing/Phasing.html#anomalous|título=The phase problem: introduction to phasing methods|autor=Read, Randy|obra=Protein Crystallography Course|editorial=Cambridge University|fechaacceso=12 de abril de 2012|fecha=26 de febrero de 2012|idioma=inglés}}</ref>

* Métodos de Patterson
* Métodos directos
* Dispersión anómala
* Reemplazamiento isomorfo
* Reemplazamiento molecular

=== Método de Patterson ===
{{AP|Método de Patterson}}

La [[Método de Patterson|función de Patterson]] se calcula efectuando la síntesis de Fourier con el cuadrado de los factores de estructura <math>|\mathbf F_{hkl}|^2</math> como coeficientes. Esta función se puede calcular directamente a partir de los datos experimentales, al no depender de la fase de los factores de estructura. En 1935, [[Arthur Lindo Patterson|Arthur Patterson]] se percató de que los máximos de esta función corresponden a los vectores que se pueden trazar entre cada par de átomos en la celda unidad, lo cual se puede utilizar en ciertos casos favorables para determinar la posición de todos o algunos átomos. En particular, el análisis de la función de Patterson se utiliza a menudo para localizar los átomos causantes de diferencias isomorfas o anómalas, lo cual es a su vez el primer paso para solucionar el problema de las fases por estos otros métodos.{{Harvnp|Sout|Jensen|1989|pp=279-291}}{{Harvnp|Luger|1980|pp=216-217}}<ref>{{Cita web|url=https://dictionary.iucr.org/Patterson_methods|título=Patterson methods|obra=Online Dictionary of Crystallography|autor=Unión Internacional de Cristalografía|enlaceautor=Unión Internacional de Cristalografía|idioma=inglés|fechaacceso=3 de abril de 2012}}</ref>

=== Métodos directos ===
La función de distribución de densidad electrónica <math>\rho (x,y,z)</math> se caracteriza por ser siempre positiva y alcanzar [[Extremos de una función|valores máximos]] alrededor de los átomos. Estas y otras propiedades derivadas de principios básicos, expresadas en forma matemática, se utilizan para discriminar entre valores de las fases que resultan en una estructura con características físicamente posibles y los que no y, por eliminación de estos últimos, elucidar la estructura de la molécula de interés. Este método se usa corrientemente para resolver el problema de las fases para moléculas pequeñas.{{Harvnp|Stout|Jensen|1989|p=248}} En contraste, en el caso de los cristales de macromoléculas, los métodos directos no suelen ser suficientes para resolver la estructura totalmente ''[[Primer principio|ab initio]]'' sin ninguna información experimental adicional; esto se debe a que, por un lado, los cristales de proteínas y moléculas de similar tamaño raramente difractan a una resolución suficiente para obtener el número de reflexiones requerido para determinar todos los parámetros atómicos y, por otro lado, al gran número de átomos en la celda unidad, que causa que las relaciones entre las probabilidades de las fases sean menos determinantes que en los casos de moléculas que cuentan con pocos átomos.<ref>{{cita publicación|publicación=Acta Crystallographica A |año=1989|volumen =45|páginas= 765-781 |doi = 10.1107/S0108767389007403 |título= Direct methods in protein crystallography|idioma=inglés|nombre= Jerome|apellido= Karle }}</ref><ref>{{cita libro|autor=Sheldrick, George. M. |año=1998|título= Direct Methods for Solving Macromolecular Structures|url=https://archive.org/details/directmethodsfor00haup |editor= S. Fortier|páginas= [https://archive.org/details/directmethodsfor00haup/page/n389 401]-411|editorial=Kluwer Academic Publishers}}</ref>

A pesar de los límites del método, sus principios también se aplican en el área de difracción de macromoléculas para mejorar las fases obtenidas por otros métodos y el cálculo de las fases a partir de un modelo de baja resolución. En la cristalografía de proteínas, las propiedades claves para discriminar entre fases correctas e incorrectas incluyen:<ref>{{cita libro|autor= Jerónimo Bravo, Nuria Verdaguer e Ignacio Fita|capítulo= Modificación de la densidad electrónica en el afinamiento y extensión de las fases en macromoléculas|título=Cristalografía|volumen=26|obra=Colección:Nuevas Tendencias|páginas=199-|editor=Félix Hernández Cano, Concepción Foces-Foces, Martín Martínez-Ripoll|editorial= [[Consejo Superior de Investigaciones Científicas|CSIC]]|año= 1995 |isbn=8400075579}}</ref>
* El contraste entre las zonas de la celda unidad ocupadas por moléculas de agua o [[solvente]] en [[sólido amorfo|estado amorfo]] y las zonas ordenadas ocupadas por la molécula.
* Una distribución característica de la probabilidad de valores de la densidad electrónica.
Al igual que la función de Patterson, los métodos directos también se utilizan para determinar las posiciones de átomos especiales en los métodos de sustitución o reemplazamiento isomorfo y de dispersión anómala.

=== Reemplazamiento isomorfo ===
El [[reemplazamiento isomorfo]] o sustitución isomorfa es un método para resolver el problema de las fases empleado predominantemente en cristalografía de macromoléculas. Consiste en la introducción en el medio de cristalización de un [[compuesto químico]] de pequeño tamaño conteniendo un átomo pesado, es decir de un número atómico elevado. Los compuestos de [[mercurio (elemento)|mercurio]], [[platino]], [[uranio]], y [[oro]] son los más utilizados, entre muchos otros.<ref>{{cita publicación|título=HAD, a Data Bank of Heavy-Atom Binding Sites in Protein Crystals: a Resource for Use in Multiple Isomorphous Replacement and Anomalous Scattering|nombre=Suhail A.|apellido= Islam|nombre2= David |apellido2=Carvin|nombre3= Michael J. E. |apellido3=Sternberg |nombre4=Tom L. |apellido4=Blundell|publicación=Acta Crystallographica D|volumen=54|páginas=1199-1206 |año=1998| idioma=inglés| doi=10.1107/S090744499800715X}}</ref><ref group=n.>El factor de forma atómico ''f'' es proporcional al [[número atómico]], por lo que la contribución al factor de estructura de un átomo pesado es significantemente mayor que la de los átomos ligeros (carbono,
oxígeno, nitrógeno e hidrógeno) predominantes en las macromoléculas orgánicas.</ref> Para que el método tenga éxito se debe establecer un [[enlace químico]] entre la molécula de interés y el átomo pesado, y la molécula modificada o «derivada» debe formar cristales isomorfos, con la misma simetría que los obtenidos a partir de la molécula «nativa» sin modificar. El factor de estructura de la molécula derivada <math>\mathbf F^{PH}_{hkl}</math> es la suma del factor de estructura «nativo» <math>\mathbf F^{P}_{hkl}</math> y la contribución del átomo pesado <math>\mathbf F^{H}_{hkl}</math>.

Las fases del átomo pesado que contribuyen a esto se pueden calcular por métodos directos a partir de las diferencias <math>\mathbf F^{PH}-\mathbf F^{P}</math>. Aunque una sola sustitución isomorfa no es suficiente para determinar <math>\mathbf F^{P}</math>, si se repite el proceso con al menos una segunda estructura derivada diferente, es posible determinar las fases para la estructura nativa, por el método conocido como reemplazamiento isomorfo múltiple o sus siglas en inglés MIR (''Multiple Isomorphous Replacement'')<ref group=n.>En ocasiones, si hay errores en los datos debidos a un isomorfismo imperfecto entre los cristales u otros factores, es necesario usar más de dos derivados para obtener fases lo suficientemente exactas.</ref><ref>{{Cita web|url=http://www.ruppweb.org/Xray/MIR/mirphasing.html|título=Multiple Isomorphous Replacement (MIR) Phasing|idioma=inglés|fechaacceso=27 de febrero de 2012|autor=Rupp, Bernhard|fecha=26 de diciembre de 2009}}</ref>

Las principal limitación de este método estriba en la dificultad de encontrar compuestos que reaccionen con la molécula a estudiar sin destruir al mismo tiempo el cristal o modificar sensiblemente su simetría o las
dimensiones de la celda unidad.

=== Dispersión anómala ===
{{AP|Difracción Anómala Simple|Difracción Anómala Múltiple}}

[[Archivo:Cu-fp-fpp.png|miniatura|Valores de las componentes del factor de estructura anómalo f" y f' alrededor de un salto de absorción.]]
El factor de forma atómica <math>f</math> no solo describe la dispersión elástica, sino también el [[efecto fotoeléctrico]], que tiene lugar cuando los electrones cambian su [[estado cuántico]] al absorber parte de la energía de los rayos{{esd}}X. El término que corresponde a la dispersión inelástica o «anómala» es un [[número complejo]]
<math>f_{A} = f'_{A} + if''_{A}</math>.<ref>{{Cita web|url=https://dictionary.iucr.org/Anomalous_dispersion|título=Anomalous dispersion|obra=Online dictionary of crystallography|autor=IUCr|enlaceautor=Unión Internacional de Cristalografía|fechaacceso=12 de abril de 2012|fecha=3 de febrero de 2012|idioma=inglés}}</ref>
Ambas componentes real <math>f'_{A}</math> e imaginaria <math>f''_{A}</math> alteran la magnitud de los factores de estructura. La componente imaginaria, relacionada con el [[coeficiente de absorción]], introduce además un cambio de fase que resulta en diferentes magnitudes de los pares Friedel  <math> \mathbf F_{hkl}</math> y <math> \mathbf F_{\bar h\bar k\bar l}</math>, idénticas en ausencia de este efecto.

La contribución anómala al factor de estructura es menor que la contribución elástica <math>f_{0}</math> y a menudo no es necesario tenerla en cuenta. Sin embargo, <math>f_{A}</math> depende de la longitud de onda de los rayos{{esd}}X y experimenta grandes variaciones cuando la energía del haz incidente es similar a la energía de un nivel atómico del átomo. Cuando <math>f'_{A}</math> y <math>f''_{A}</math> alcanzan sus valores máximos los cambios en la magnitud y fase de los factores de estructura pueden ser significativos. Si algunos átomos en la molécula resultan afectados por este tipo de interacción, se pueden hallar sus posiciones en la celda unidad analizando las diferencias de intensidad entre las mismas reflexiones medidas a distintas longitudes de onda, o entre los pares de Friedel a la misma longitud de onda. Dichas diferencias se pueden utilizar para resolver el problema de las fases, por el método [[Difracción Anómala Múltiple|MAD]] (''Multiwavelength Anomalous Dispersion/Diffraction'' o ‘dispersión/difracción anómala a múltiples longitudes de onda’)<ref>{{Cita web|url=https://dictionary.iucr.org/|título=Multiwavelength anomalous diffraction (MAD)|obra=Online dictionary of crystallography|autor=IUCr|enlaceautor=Unión Internacional de Cristalografía|fechaacceso=12 de abril de 2012|fecha=11 de abril de 2008|idioma=inglés}}</ref> o [[Difracción Anómala Simple|SAD]] (''Single-wavelength Anomalous Dispersion/Diffraction'' o ‘dispersión/difracción anómala a una sola longitud de onda’){{Refn|1=Se necesitan al menos dos longitudes de onda diferentes para resolver el problema de las fases solamente por este método, pero una longitud de onda basta si se aplican restricciones adicionales sobre la función de densidad electrónica.<ref>{{cita publicación|título=Jolly SAD|apellidos=Dauter|nombre=Zbigniew|apellidos2=Dauter|nombre2=Miroslawa|apellidos3=Dodson|nombre3=Eleanor|publicación=Acta Crystallographica Section D|año=2002|volumen=58|páginas=494-506|doi=10.1107/S090744490200118X}}</ref> |group=n.}}

La mayoría de los átomos pesados usados en el método de reemplazamiento isomorfo exhiben una dispersión anómala importante en el rango de longitudes de onda usado en los experimentos cristalográficos, por lo cual estas dos técnicas se usan a veces en conjunción. La ventaja de los métodos basados en la dispersión anómala es que, al precisar en principio solo un cristal para determinar las fases, no están limitados por un isomorfismo imperfecto. El uso de [[radiación sincrotrón]], que se puede sintonizar a las longitudes de onda que optimizan la dispersión anómala, ha resultado en un fuerte incremento de la popularidad del método.

=== Reemplazamiento molecular ===
El método de [[reemplazamiento molecular]] consiste en el empleo de una molécula de estructura conocida para calcular las fases iniciales de una segunda molécula con elementos estructurales comunes con la primera. Este es el método más usado para determinar la estructura de macromoléculas como las proteínas, ya que muchas de ellas se agrupan en familias con una estructura similar o forman complejos supramoleculares en los que se conoce la estructura de una o más componentes.<ref>{{cita libro|autor= Santiago García-Granda y Javier Borge|capítulo= Resolución estructural «Ab Initio» de moléculas orgánicas y proteínas por aplicación de funciones de rotación y traslación |título=Cristalografía|volumen=26|obra=Colección:Nuevas Tendencias|páginas=199-|editor=Félix Hernández Cano, Concepción Foces-Foces, Martín Martínez-Ripoll|editorial= [[Consejo Superior de Investigaciones Científicas|CSIC]]|año= 1995 |isbn=8400075579}}</ref><ref name=dodson>{{cita publicación|autor=Dodson, Eleanor|título=The befores and afters of molecular replacement|publicación=Acta Crystallographica D|año= 2008 |volumen=64|páginas= 17–24| doi= 10.1107/S0907444907049736 }}</ref>

La desventaja del reemplazamiento molecular es que las fases obtenidas están sesgadas hacia la estructura utilizada como punto de partida, lo que no ocurre con las técnicas basadas enteramente en los datos de difracción experimentales y conocimiento ''a priori'' de las propiedades químicas o estructurales del material. El éxito de este método depende de algoritmos sofisticados para detectar y eliminar este sesgo durante el refinamiento de las fases.<ref name=dodson />
[[Archivo:Helix electron density myoglobin 2nrl 17-32.jpg|miniatura|izquierda|La obtención de las fases permite calcular un mapa de densidad electrónica (mostrado en blanco), a partir del cual se construye el modelo de la estructura. El modelo suele consistir en líneas, representando los enlaces atómicos, o puntos, representando átomos individuales. En la figura se usan ambas representaciones.]]

== Refinamiento de la estructura ==
Una vez calculada la función <math>\rho(x,y,z)</math> a partir de las fases, se puede construir un modelo de la estructura en el mapa de densidad
electrónica, descrito por un número de parámetros: las posiciones de cada átomo <math>x_{j}</math>,
<math>y_{j}</math> y <math>z_{j}</math>, su [[factor de temperatura]]
<math>B_{j}</math> representando los desplazamientos de los átomos con respecto a su posición media, etc.{{Harvnp|Luger|1980|p=267}}<ref group=n.>El número de parámetros usados para representar el modelo depende de la resolución de la difracción. Para que el refinamiento sea efectivo, el número de reflexiones independientes —no relacionadas por simetría— debe ser mayor que los parámetros que se pretenden refinar.</ref> La determinación inicial de estos parámetros puede ser incorrecta, debido a errores en la determinación de las fases o fallos de interpretación de la densidad
electrónica.<ref>{{Cita web|url=http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/Course/Overview/Overview.html|título=Overview of macromolecular X-ray crystallography|autor=Read,Randy|obra=Protein crystallography course|editorial=University of Cambridge|año=2008|fechaacceso=6 de abril de 2012}}</ref> Durante el refinamiento, se modifica reiterativamente el modelo y a continuación se compara el módulo de los factores de estructura <math>\mathbf F_c</math> calculados a partir de este con el de los factores de estructura experimentales <math>\mathbf F</math>, hasta que la diferencia entre ambos sea mínima. La figura de mérito utilizada para la comparación es el factor R, definido como:{{Harvnp|Luger|1980|p=267}}

<math>
R = \frac {\sum ||\mathbf F| - |\mathbf F_c||}{\sum |\mathbf F|}
</math>

La suma se realiza sobre todas las reflexiones <math>hkl</math>.

Se usan dos técnicas matemáticas para ajustar los parámetros del modelo durante el refinamiento: los [[mínimos cuadrados]] y la [[máxima verosimilitud]]. El segundo método requiere más recursos computacionales, pero es más general y se aplica con preferencia en problemas difíciles, como macromoléculas y difracción a baja resolución.{{Harvnp|Drenth|1999|p=268}}<ref>{{Cita web|url=http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/Course/Likelihood/likelihood.html|título=Likelihood: theory and application to structure refinement|autor=Read,Randy|obra=Protein crystallography course|editorial=University of Cambridge|año=2009|fechaacceso=6 de abril de 2012}}</ref>

== Cristalización ==
{{AP|Cristalización}}
[[Archivo:X-ray_crystals_-_slow_gas_diffusion_2_solvent.png|miniatura|Esquema ilustrativo del método de difusión de vapor para obtener cristales para su estudio por rayos X.]]
Para obtener datos de difracción de un cristal, este debe cumplir ciertos requisitos en cuanto a tamaño, pureza y regularidad de la red cristalina. Aunque a veces es posible utilizar cristales de metales o minerales inorgánicos formados por medios naturales, a menudo es necesario prepararlos mediante recristalización o [[precipitado|precipitación]] del
material en una [[disolución|solución líquida sobresaturada]] en condiciones controladas de [[concentración]] y temperatura. En el método de cristalización por difusión de vapor, la solución que contiene el material a cristalizar junto con un precipitante alcanza un [[estado de equilibrio termodinámico]] con otra solución más concentrada del precipitante, por difusión del disolvente hacia esta a través del aire; esta técnica se usa tanto para moléculas de pocos átomos como para proteínas y otras macromoléculas.<ref name=smallcryst>{{cita publicación|título= Some thoughts about the single crystal growth of small molecules|nombre= Bernhard | apellidos=Spingler| nombre2=Stephan|apellidos2= Schnidrig|nombre3=Tonya|apellidos3=Todorova|nombre4=Ferdinand |apellidos4=Wilda |publicación=CrystEngComm|año= 2012 |volumen=14 |páginas= 751-757|idioma=inglés|doi= 10.1039/C1CE05624G}}</ref><ref>{{cita web|url=http://www.proteinstructures.com/Experimental/Experimental/protein-crystallization.html|título=Protein Crystallization: Basic Approach|fechaacceso=1 de octubre de 2013|autor=Al Karadaghi, Salam|fecha=2012|obra=Experimental Methods in Structural Biology|idioma=inglés|urlarchivo=https://web.archive.org/web/20201204144319/https://proteinstructures.com/Experimental/Experimental/protein-crystallization.html|fechaarchivo=4 de diciembre de 2020}}</ref> Un segundo método es la cristalización en [[gel]]es, muy útil para cristalizar materiales insolubles; esta técnica, lenta comparada con la difusión de vapor,<ref name=smallcryst/> consiste en la introducción de un [[reactivo|reactante]] en un gel antes de que este se endurezca. Posteriormente se introduce otra solución de un segundo reactante en la capa superior del gel, desde donde se difunde al resto de la matriz y reacciona con la primera sustancia para dar lugar a cristales.<ref>{{cita publicación|título=Crystal growth in gels|url=https://archive.org/details/sim_journal-of-chemical-education_1985-01_62_1/page/81|nombre=Steven L. |apellido=Suib|publicación=J. Chem. Educ.|año= 1985|volumen= 62 |número=1|páginas = 81-82 |doi=10.1021/ed062p81|idioma=inglés}}</ref>

Las condiciones de preparación de cristales deben también ser las adecuadas para obtener cristales de un tamaño óptimo para su estudio por difracción de rayos X; la talla ideal está determinada por la densidad y composición de la muestra: mientras que los cristales de gran tamaño atenúan excesivamente los rayos X y suelen presentar irregularidades en la matriz cristalina, los de talla muy pequeña difractan débilmente. En el caso de cristales de materiales orgánicos, son preferibles los cristales de unas décimas de milímetro; no obstante, cuando se usan fuentes de rayos X muy intensas, como [[láser de electrones libres|láseres de electrones libres]] o [[Sincrotrón|líneas de luz sincrotrón]] modernas, es posible trabajar con cristales de dimensiones de unos veinte [[Micrómetro (unidad de longitud)|μm]] o incluso menores.<ref>{{cita publicación|publicación = Curr Opin Struct Biol. |año=2012 |volumen=22 |número=5 |páginas=602-612| doi= 10.1016/j.sbi.2012.09.001|título= Micro-crystallography comes of age|apellido = Smith |nombre=J.L. |apellido2= Fischetti |nombre2=R.F. |apellido3= Yamamoto| nombre3= M.|idioma=inglés}}</ref><ref>{{cita publicación|publicación = Nature |año=2011 |volumen=470 |páginas=73-77 |doi = 10.1038/nature09750|título= Femtosecond X-ray protein nanocrystallography |autor = Chapman, H.N. ''et al''|idioma=inglés}}</ref> Para las aplicaciones de cristalografía en polvo, se requieren al menos varios cientos de miligramos de material machacado hasta formar cristales de aproximadamente diez μm o menores.<ref>{{cita web|url=http://serc.carleton.edu/research_education/geochemsheets/techniques/XRD.html|obra=Geochemical Instrumentation and Analysis|título=X-ray Powder Diffraction (XRD) |autor= Dutrow, Barbara L. y Clark, Christine M.|fechaacceso= 1 de octubre de 2013|fecha = 24 de agosto de 2013|editorial= Science Education Research Center at Carleton College|idioma=inglés}}</ref>

== Adquisición de datos ==
=== Fuentes de rayos X ===
{{AP|Tubo de rayos X|Sincrotrón|Láser de electrones libres}}

[[Archivo:Macromolecular-Crystallography-beamline.png|miniatura|Estación de sincrotrón para experimentos de cristalografía usando el método de rotación. El haz de rayos{{esd}}X, de un par de décimas de mm se dirige al cristal, de aproximadamente el mismo tamaño, desde la izquierda de la imagen. El cristal se emplaza sobre un [[difractómetro]], que permite orientar y girar el cristal para obtener un conjunto de reflexiones lo más completo posible. El patrón de difracción se graba en el detector bidimensional mostrado a la derecha, en este caso una pantalla de material sensible a los rayos{{esd}}X conectada a una cámara de [[dispositivo de carga acoplada|CCD]] por medio de [[fibra óptica]].]]

Los experimentos de cristalografía de rayos{{esd}}X se pueden realizar, o bien con un [[tubo de rayos X]] o usando la [[radiación sincrotrón]] emitida por [[acelerador de partículas|aceleradores de partículas]]. En los tubos de rayos{{esd}}X, se aplica un voltaje para acelerar un haz de electrones producidos por calentamiento de un filamento de [[wolframio]] —el [[cátodo]]. Los electrones acelerados colisionan contra un material metálico —el [[ánodo]]— y durante la consiguiente desaceleración emiten [[Bremsstrahlung|radiación de ''Bremsstrahlung'']] de espectro continuo, es decir, compuesta de múltiples longitudes de onda. El ánodo absorbe parte de los rayos X emitidos por los electrones y emite a su vez rayos{{esd}}X de las longitudes de onda características del metal. Por ejemplo, un ánodo de cobre emite principalmente en la longitud de onda de 1,5405&nbsp;[[Angstrom|Å]]. La radiación de ''Bremsstrahlung'' y otras líneas de emisión características menos intensas se filtran con un metal absorbente. En el ejemplo del ánodo de cobre, se utiliza [[níquel]], que es bastante transparente a los rayos{{esd}}X de {{nowrap|1,5405 Å}}, pero absorbe eficazmente la radiación a longitudes de onda menores, obteniéndose un haz de rayos X bastante monocromático.{{Harvnp|Luger|1980}} Los tubos de rayos{{esd}}X son relativamente baratos y los laboratorios de investigación los suelen utilizar para realizar experimentos ''in situ''.

La radiación sincrotrón se obtiene cuando un haz de electrones<ref group=n.>Es posible usar [[positron]]es u otra partícula con carga eléctrica para este fin, pero se usan electrones en la mayoría de los casos.</ref> acelerados hasta alcanzar una velocidad cercana a la de la luz es desviado de su trayectoria por medio de un [[campo magnético]]. El espectro de la radiación sincrotrón depende del tipo de dispositivo magnético usado para curvar la trayectoria de los electrones: los [[Imán dipolar|imanes dipolares]] y ''[[wiggler]]s'' procucen radiación de espectro continuo muy amplio, mientras que los rayos{{esd}}X emitidos por los [[ondulador]]es presentan máximos de amplitud a ciertas longitudes de onda. La longitud de onda deseada para el experimento se puede seleccionar mediante un [[monocromador]]. Las [[sincrotrón|fuentes de radiación sincrotrón]] emiten rayos{{esd}}X mucho más intensos que los generados por los tubos y son necesarias para mejorar la calidad de la difracción cuando los cristales son muy pequeños o están compuestos de átomos ligeros, que interaccionan débilmente con los rayos{{esd}}X.

Durante los años 2010 empezaron a entrar en funcionamiento varios [[Láser de electrones libres|láseres de electrones libres]] diseñados para la producción de rayos{{esd}}X. Los pulsos de radiación emitida por estos dispositivos son del orden de [[femtosegundo]]s —entre tres y cuatro órdenes de magnitud menores que los producidos las fuentes de radiación sincrotrón convencionales— y de alta intensidad. Estas propiedades permiten la investigación de procesos físicos o químicos que tienen lugar en escalas de tiempo muy rápidas y el estudio de cristales del tamaño de una micra mediante la nueva técnica de «cristalografía en serie a escala de femtosegundos», especialmente relevante para la cristalografía de [[Proteína de membrana|proteínas de membrana]].<ref name="bioscirep17">{{Cita publicación |url=https://portlandpress.com/bioscirep/article/37/4/BSR20170204/57104/New-developments-in-crystallography-exploring-its |título=New developments in crystallography: exploring its technology, methods and scope in the molecular biosciences |apellidos=Helliwell |nombre=John R. |fecha=2017-08-31 |publicación=Bioscience Reports |volumen=37 |número=4 |páginas=BSR20170204 |fechaacceso=2021-12-13 |idioma=en |issn=0144-8463 |doi=10.1042/BSR20170204 |pmc=6434086 |pmid=28572170}}</ref>

=== Detectores ===
{{AP|Rayos X|l1=Rayos X (apartado «Detectores de rayos X»)}}

Existen varios tipos de detectores usados en los experimentos de cristalografía. El detector bidimensional más usado durante mucho tiempo fue la [[película fotográfica]], actualmente reemplazada por otros detectores más sensibles a los rayos{{esd}}X. Otro detector clásico es el [[contador proporcional]] unidimensional, normalmente un [[Centelleador|detector de centelleo]], instalado en un difractómetro y controlado por ordenador. Este tipo de detector mide las reflexiones una a una y todavía se usa para la cristalografía de moléculas pequeñas, pero es poco eficaz en los experimentos con macromoléculas, donde el número de reflexiones ronda entre 10{{esd}}000 y 100{{esd}}000.{{Harvnp |Drenth|1999|p=35}}

A partir de los años 1990 empezaron a aparecer nuevos detectores, como las «placas de imagen» (''image plates''). Las placas de imagen están recubiertas de un material [[fosforescencia|fosforescente]], donde los electrones incrementan su energía al absorber los rayos{{esd}}X difractados y son atrapados en este nivel en [[centro de color|centros de color]]. Los electrones liberan la energía al iluminarse la placa con [[láser|luz láser]], emitiendo luz con intensidad proporcional a la de la reflexión. Estos detectores son un orden de magnitud más sensibles que la película fotográfica y poseen un [[Rango dinámico|margen dinámico]] superior en varios órdenes de magnitud, lo que facilita la medición simultánea de las reflexiones más intensas y las más débiles. Otros detectores usados en la actualidad son detectores electrónicos, conocidos como detectores «de área», que procesan la señal inmediatamente tras la detección de los rayos{{esd}}X. Pueden ser [[cámara de ionización|cámaras de ionización]] o una placa fosforescente acoplada a una cámara [[dispositivo de carga acoplada|CCD]].{{Harvnp |Drenth|1999|pp=34-35}} En los años 2000 se empezaron a utilizar [[Diodo PIN|fotodiodos]] alineados formando una placa, denominados PAD (''Pixel Array Detectors''). Estos detectores se caracterizan por un gran margen dinámico y un tiempo muerto entre imágenes muy bajo, del orden de milisegundos.<ref>{{cita publicación|título=A Pixel-Array Detector for Time-Resolved X-ray Diffraction|nombre=E F |apellidos=Eikenberry|nombre2= S L |apellidos2=Barna |nombre3=M W |apellidos3=Tate | nombre4=G |apellidos4=Rossi|nombre5= R L |apellidos5=WixtedP J Sellin|nombre6= S M |apellidos=Gruner|publicación=Journal of Synchrotron Radiation |año=1998|volumen = 5 |páginas= 252-255
|idioma=inglés| PMID=15263487 }}</ref>

=== Geometrías de difracción ===
Existen tres métodos tradicionales para medir la difracción de rayos{{esd}}X: el método de Laue, el método de rotación y el método de polvo. Una nueva técnica, la cristalografía en serie, se ha desarrollado en las primeras décadas del {{siglo|XXI||s}}.

==== Método de Laue ====
[[Archivo:Laue-Cubic-Disoriented.PNG|miniatura|Patrón de difracción obtenido por el método de Laue en transmisión: las reflexiones dispuestas a lo largo de una curva son generadas por una misma longitud de onda.]]  
Consiste en hacer incidir en un cristal un espectro continuo de rayos{{esd}}X, de tal manera que para cada longitud de onda se cumple la ley de Bragg para diferentes puntos de la red recíproca. Esto posibilita medir todas o casi todas la reflexiones sin cambiar la orientación del cristal. Existen dos variantes del método de Laue: transmisión y reflexión. En el método de Laue por transmisión, el cristal se emplaza entre la fuente de rayos{{esd}}X y el detector. En método de reflexión, el detector se encuentra entre la fuente y el cristal, para detectar los haces difractados hacia atrás.<ref name=matter>{{Cita web|url=http://www.matter.org.uk/diffraction/x-ray/laue_method.htm|título=The Laue method|editorial=Matter, [[Universidad de Liverpool]]|fecha=25 de julio de 2000|fechaacceso=27 de marzo de 2012|urlarchivo=https://web.archive.org/web/20120531065245/http://www.matter.org.uk/diffraction/x-ray/laue_method.htm|fechaarchivo=31 de mayo de 2012}}</ref>

A pesar de ser el método utilizado en los primeros experimentos cristalográficos, el método de Laue se usaba muy poco para la determinación de estructuras debido principalmente a la baja intensidad de la radiación de espectro continua producida por los tubos de rayos{{esd}}X en comparación con la emisión característica monocromática. El creciente uso de la radiación sincrotrón ha fomentado el resurgimiento del método. La capacidad de medir todos los datos necesarios para la determinación de la estructura en un corto tiempo lo convierte en el método más apropiado para el estudio de [[reacción química|reacciones químicas]] que tienen lugar en pocos segundos, como [[catálisis]] por [[enzima]]s y [[zeolita]]s y los efectos de perturbaciones causadas por campos eléctricos, cambios de [[presión]] y [[temperatura]], etc. en diversos materiales.{{Harvnp|Helliwell|1992|p=276}}

==== Métodos de rotación de cristal ====
[[Archivo:X-ray diffraction pattern 3clpro.jpg|miniatura|izquierda|Patrón de difracción obtenido por rotación de un cristal. El uso de ordenadores para la interpretación de las imágenes obtenidas por este método lo ha transformado en el modo preferido de medición de datos en la mayoría de las aplicaciones.]][[Archivo:CuZn SOD precession photo C2.jpg|miniatura|Patrón de difracción obtenido por el método de precesión. Este método resulta en una representación sin distorsiones de los planos de la red recíproca.]] 
Se hace incidir un haz de [[rayos X]] monocromáticos sobre un cristal, que rota a una velocidad constante alrededor de un eje perpendicular a los rayos{{esd}}X. La rotación del cristal causa que todos los puntos de la red recíproca atraviesen consecutivamente la esfera de Ewald, logrando así medir las reflexiones necesarias. Existen diferentes variantes de este método. En el [[método de Weissenberg]] se usa una cámara de forma cilíndrica rodeando al cristal tal que el eje de rotación del cristal coincide con el eje del cilindro. La cámara se traslada a medida que el cristal gira para que las reflexiones estén separadas. En el [[método de precesión]], la cámara es plana, y rota alrededor de un eje paralelo al eje de rotación del cristal. En ambos métodos se usa una pantalla para medir solo una sección bidimensional de la red recíproca en cada imagen.{{Harvnp|Luger|1980|pp=52-79}}{{Harvnp|Stout|Jensen|1989|pp=93-136}} Estos métodos facilitan la determinación de la orientación del cristal y los índices de las reflexiones, pero son lentos e ineficientes. Los avances en computación de los años 90 posibilitaron un diseño más simple, en el que el detector se mantiene estacionario detrás del cristal, usándose [[programa informático|programas]] para hallar automáticamente la orientación y los parámetros cristalinos consistentes con el patrón de difracción observado.<ref>{{Cita web|url=http://xray0.princeton.edu/~phil/Facility/Guides/XrayDataCollection.html|título=X-ray Data Collection Course|autor=Jeffrey, Phil|fecha=febrero de 2006|fechaacceso=28 de marzo de 2012|idioma=inglés|fechaarchivo=7 de enero de 2012|urlarchivo=https://web.archive.org/web/20120107074630/http://xray0.princeton.edu/~phil/Facility/Guides/XrayDataCollection.html|deadurl=yes}}</ref>

==== Método de polvo cristalino ====
[[Archivo:Si powder diffraction pattern.png|miniatura|Patrón de difracción de polvo. Debido al uso de múltiples cristales en múltiples orientaciones los puntos de difracción correspondientes a los puntos de la red recíproca a la misma distancia del origen ''d'' se unen para formar un anillo.]]
En el [[Difracción de polvo|método de polvo cristalino]] o de Debye-Scherrer,{{Refn|1=Este método fue propuesto por [[Peter Debye]] y [[Paul Scherrer]] en 1916 e independientemente por [[Albert Hull]] en 1917.<ref name=50years />|group=n.}} el cristal a analizar es pulverizado de tal manera que forme un conjunto de microcristales en todas las posibles orientaciones de la red recíproca. Con esta geometría todas las reflexiones se pueden medir en un solo patrón de difracción, consistente en círculos, uno para cada reflexión. Aunque el método de rotación de cristal resulta en valores más exactos de la intensidad de las reflexiones, el método de polvo es a veces la única opción cuando el material a estudiar no forma monocristales de un tamaño suficiente para producir difracción detectable. Este método se usa mayoritariamente cuando no es necesario determinar la estructura; por ejemplo, en el análisis de minerales presentes en una muestra.<ref name=ined-drx>{{Cita web|url=http://www.uned.es/cristamine/cristal/drx_mrc.htm|título=Métodos de difracción de rayos X|obra=Curso de cristalografía|editorial=[[Universidad Nacional de Educación a Distancia]], Facultad de Ciencias|fechaacceso=1 de abril de 2012|fechaarchivo=29 de octubre de 2015|urlarchivo=https://web.archive.org/web/20151029143133/http://www.uned.es/cristamine/cristal/drx_mrc.htm|deadurl=yes}}</ref>
==== Cristalografía en serie ====
La cristalografía en serie consiste en trasladar un medio o una placa que contiene cristales —generalmente de un tamaño de micras o menor— a través de un haz de rayos{{esd}}X, mientras que un detector registra datos continuamente para medir la difracción generada por los cristales a medida que atraviesan el haz. Un grupo de investigadores dirigidos por Janos Hajdu propusieron este método en el año 2000 como una manera de sacar partido de la corta duración de los pulsos de radiación generados por los [[Láser de electrones libres|láseres de electrones libres de rayos X]] para obtener datos de microcristales o partículas biológicas —por ejemplo, [[virus]]— antes de su destrucción por los procesos de [[ionización]] inducidos por los rayos X.<ref name="neutze2000">{{Cita publicación |url=http://www.nature.com/articles/35021099 |título=Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses |apellidos=Neutze |nombre=Richard |apellidos2=Wouts |nombre2=Remco |fecha=2000-08 |publicación=Nature |volumen=406 |número=6797 |páginas=752–757 |fechaacceso=2021-12-17 |idioma=en |issn=0028-0836 |doi=10.1038/35021099 |apellidos3=van der Spoel |nombre3=David |apellidos4=Weckert |nombre4=Edgar |apellidos5=Hajdu |nombre5=Janos}}</ref> El concepto, popularizado como «''diffract before destroy''», 'difractar antes de destruir',<ref>{{Cita publicación |url=http://www.nature.com/articles/nmeth0411-283 |título=Diffraction before destruction |apellidos=Doerr |nombre=Allison |fecha=2011-04 |publicación=Nature Methods |volumen=8 |número=4 |páginas=283–283 |fechaacceso=2021-12-17 |idioma=en |issn=1548-7091 |doi=10.1038/nmeth0411-283}}</ref> fue demostrado experimentalmente poco tiempo después de que el primer láser de electrones libres —LCLS, ubicado en el [[SLAC National Accelerator Laboratory|Laboratorio Nacional de Aceleradores SLAC]]— entrara en funcionamiento en 2009.<ref name="nature2010">{{Cita publicación |url=http://www.nature.com/articles/nature09750 |título=Femtosecond X-ray protein nanocrystallography |apellidos=Chapman |nombre=Henry N. |apellidos2=Fromme |nombre2=Petra |fecha=2011-02 |publicación=Nature |volumen=470 |número=7332 |páginas=73–77 |fechaacceso=2021-12-17 |idioma=en |issn=0028-0836 |doi=10.1038/nature09750 |pmc=3429598 |pmid=21293373 |apellidos3=Barty |nombre3=Anton |apellidos4=White |nombre4=Thomas A. |apellidos5=Kirian |nombre5=Richard A. |apellidos6=Aquila |nombre6=Andrew |apellidos7=Hunter |nombre7=Mark S. |apellidos8=Schulz |nombre8=Joachim |apellidos9=DePonte |nombre9=Daniel P.}}</ref>

La técnica, denominada «cristalografía en serie de femtosegundos», experimentó un fuerte desarrollo en poco tiempo, gracias a los avances realizados en la preparación e identificación de microcristales; en el desarrollo de instrumentación para medir la difracción a alta velocidad; y en la introducción de nuevos programas y algoritmos para analizar los datos obtenidos.<ref name="iucrj2015">{{Cita publicación |url=http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S205225251402702X |título=Serial femtosecond crystallography: the first five years |apellidos=Schlichting |nombre=Ilme |fecha=2015-03-01 |publicación=IUCrJ |volumen=2 |número=2 |páginas=246–255 |fechaacceso=2021-12-17 |issn=2052-2525 |doi=10.1107/S205225251402702X |pmc=4392417 |pmid=25866661|idioma=en}}</ref> La nueva tecnología ha sido adoptada también en las líneas de rayos X de los sincrotrones (cristalografía en serie de sinchrotrón); los pulsos de luz de los sincrotrones que permiten la investigación de muchos procesos y reacciones importantes que tienen lugar en una escala temporal del milisegundos y estas instalaciones son más numerosas y accesibles que los láseres de electrones libres.<ref name="bioscirep17" /><ref>{{Cita publicación |url=https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0959440X20301184 |título=Serial synchrotron crystallography for time-resolved structural biology |apellidos=Pearson |nombre=Arwen R |apellidos2=Mehrabi |nombre2=Pedram |fecha=2020-12 |publicación=Current Opinion in Structural Biology |volumen=65 |páginas=168–174 |fechaacceso=2021-12-21 |idioma=en |doi=10.1016/j.sbi.2020.06.019}}</ref>

Existen dos métodos principales de transportar los microcristales al punto de interacción con los rayos{{esd}}X: el primero se basa en producir un goteo o un chorro muy fino de cristales en suspensión en un medio líquido más o menos viscoso que interseca el haz de rayos{{esd}}X. El segundo método, inspirado más directamente en las técnicas de rotación de cristales, consiste en distribuir los cristales sobre la superficie de un material transparente a los rayos X conectada a un diffractómetro convencional u otro aparato motorizado para poder escanear el área ocupada por los cristales.<ref>{{Cita publicación |url=http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S2059798318017953 |título=Strategies for sample delivery for femtosecond crystallography |apellidos=Martiel |nombre=Isabelle |apellidos2=Müller-Werkmeister |nombre2=Henrike M. |fecha=2019-02-01 |publicación=Acta Crystallographica Section D Structural Biology |volumen=75 |número=2 |páginas=160–177 |fechaacceso=2021-12-21 |idioma=en |issn=2059-7983 |doi=10.1107/S2059798318017953 |pmc=6400256 |pmid=30821705 |apellidos3=Cohen |nombre3=Aina E.}}</ref>

== Aplicaciones ==
La cristalografía tiene muchas aplicaciones en una gran variedad de disciplinas científicas, como la [[mineralogía]], la [[química]], la [[biología molecular]], la [[farmacología]],<ref>{{Cita publicación|url=https://www.scielo.br/j/aabc/a/kg89S5BvDGLgWCC4T9Y7hgJ/?lang=en |título=The development and characterization of Propranolol Tablets using Tapioca starch as excipient|apellidos=Fernandes|nombre=Julyane B.M.|apellidos2=Celestino|nombre2=Maísa T.|fecha=8 de abril de 2019|publicación=Anais da Academia Brasileira de Ciências|volumen=91|número=1|fechaacceso=2 de junio de 2019|issn=1678-2690|doi=10.1590/0001-3765201920180094|apellidos3=Tavares|nombre3=Maria I.B.|apellidos4=Freitas|nombre4=Zaida M.F.|apellidos5=Santos|nombre5=Elisabete P. Dos|apellidos6=Ricci Júnior|nombre6=Eduardo|apellidos7=Monteiro|nombre7=Mariana S.S.B.}}</ref> la [[geología]], la [[física aplicada]] y la [[ciencia de materiales]].<ref>{{Cita publicación|url=http://quimicanova.sbq.org.br/audiencia_pdf.asp?aid2=6880&nomeArquivo=AR20180385.pdf|título=COMPARATIVE STUDY OF TiO2 AND ZnO APPLICATION IN HYBRID SOLAR CELLS USING COPOLYMER P3OT/P3MT|apellidos=Larsson|nombre=Letícia|apellidos2=Tractza|nombre2=Gideã|fecha=2019|publicación=Química Nova|fechaacceso=2 de junio de 2019|doi=10.21577/0100-4042.20170344|apellidos3=Maia|nombre3=Guilherme|apellidos4=Alves|nombre4=Guilherme|apellidos5=Rodrigues|nombre5=Paulo|apellidos6=Cunha|nombre6=Maico|apellidos7=Banczek|nombre7=Everson}}</ref><ref>{{cita web|url=http://www.xtal.rwth-aachen.de/Ww/memo_e.html#memo3|editorial=Deutsche Gesellschaft für Kristallographie|editor=T. Hahn|título=Crystallography: current and future tasks|año=1990-1991|fechaacceso=13 de abril de 2012|urlarchivo=https://web.archive.org/web/20140517223854/http://www.xtal.rwth-aachen.de/aw/cms/XTAL/Themen/home/~wkx/was_ist_kristallographie/?lang=en| fechaarchivo=2014-05-17|idioma=inglés}}</ref><ref>{{cita web|url=http://triplenlace.com/2012/02/06/que-es-la-cristalografia-de-proteinas/|autor=Ibáñez Muñoz, Sonia|título=¿Qué es la cristalografía de proteínas?|fechaacceso=13 de abril de 2012|urlarchivo=https://web.archive.org/web/20130610034550/http://triplenlace.com/2012/02/06/que-es-la-cristalografia-de-proteinas/|fechaarchivo=10 de junio de 2013}}</ref> Asimismo, las diferencias en el patrón de difracción de diversos materiales,<ref>{{Cita publicación|url=https://www.scielo.br/j/mr/a/Fxj6LYWv3L9pBrLdXyHPqgG/?lang=en |título=New Peritectoid Reaction Identified at the MnSb Alloy|apellidos=Iwamoto|nombre=Gerson Yoshinobu|apellidos2=Rodrigues|nombre2=Christiane de Arruda|fecha=8 de abril de 2019|publicación=Materials Research|volumen=22|número=suppl 1|fechaacceso=2 de junio de 2019|issn=1980-5373|doi=10.1590/1980-5373-mr-2018-0647|apellidos3=Iwamoto|nombre3=Luciana Aparecida de Sousa|apellidos4=Vieira|nombre4=Rogerio de Almeida}}</ref><ref>{{Cita publicación|url=https://www.scielo.br/j/mr/a/7fgYLHzbGx6L9SMxSDXFmBB/?lang=en|título=Morphology of the DIN 100Cr6 Case Hardened Steel after Plasma Nitrocarburizing Process|apellidos=Fontes|nombre=Marcos Alves|apellidos2=Scheid|nombre2=Vladimir Henrique Baggio|fecha=4 de abril de 2019|publicación=Materials Research|volumen=22|número=3|fechaacceso=2 de junio de 2019|issn=1980-5373|doi=10.1590/1980-5373-mr-2018-0612|apellidos3=Machado|nombre3=David de Souza|apellidos4=Casteletti|nombre4=Luiz Carlos|apellidos5=Nascente|nombre5=Pedro Augusto de Paula}}</ref> hielo,<ref>{{Cita publicación|url=https://www.nature.com/articles/s41570-019-0080-8|título=Surface premelting of water ice|apellidos=Angelos Michaelides|apellidos2=Slater|nombre2=Ben|fecha=2019-03|publicación=Nature Reviews Chemistry|volumen=3|número=3|páginas=172–188|fechaacceso=2 de junio de 2019|idioma=en|issn=2397-3358|doi=10.1038/s41570-019-0080-8}}</ref> sean minerales, drogas, pigmentos, adsorbentes,<ref>{{Cita publicación|url=https://www.nature.com/articles/s41570-019-0073-7|título=Porous metal–organic frameworks as emerging sorbents for clean air|apellidos=Schröder|nombre=Martin|apellidos2=Yang|nombre2=Sihai|fecha=2019-02|publicación=Nature Reviews Chemistry|volumen=3|número=2|páginas=108–118|fechaacceso=2 de junio de 2019|idioma=en|issn=2397-3358|doi=10.1038/s41570-019-0073-7|apellidos3=Han|nombre3=Xue}}</ref> catalizadores,<ref>{{Cita publicación|url=https://pure.mpg.de/rest/items/item_1896844_6/component/file_1896843/content|título=The reaction network in propane oxidation over phase-pure MoVTeNb M1 oxide catalysts|apellidos=|nombre=|fecha=2014|publicación=J. Catal.|número=311|páginas=369-385|fechaacceso=|doi=|pmid=}}</ref><ref>{{Cita publicación|url=https://pure.mpg.de/rest/items/item_1108560_8/component/file_1402724/content|título=Surface chemistry of phase-pure M1 MoVTeNb oxide during operation in selective oxidation of propane to acrylic acid|apellidos=|nombre=|fecha=2012|publicación=J. Catal.|número=285|páginas=48-60|fechaacceso=|doi=|pmid=}}</ref><ref>{{Cita libro|apellidos=|nombre=|enlaceautor=|título=Kinetic studies of propane oxidation on Mo and V based mixed oxide catalysts|url=https://pure.mpg.de/rest/items/item_1199619_5/component/file_1199618/content|fechaacceso=|año=2011|editorial=|isbn=|editor=|ubicación=|página=|idioma=Inglés|capítulo=}}</ref> etc., con aspectos y composiciones químicas similares son de mucha utilidad en la industria y campos sin relación directa con la investigación científica básica o el desarrollo tecnológico, como la [[criminología|ciencia forense]] o la [[historia del arte]].<ref>{{cita noticia|url=http://www.uimp.es/blogs/prensa/2011/08/11/expertos-en-cristalografia-lamentan-la-carencia-de-tecnicos-en-espana-y-apuestan-por-la-divulgacion-para-%E2%80%9Cfomentar-las-vocaciones%E2%80%9D/|título=Expertos en Cristalografía lamentan la carencia de técnicos en España y apuestan por la divulgación para “fomentar las vocaciones”|autor=Gabinete de comunicación de la [[Universidad Internacional Menéndez Pelayo]]|fecha=11 de agosto de 2011|fechaacceso=13 de abril de 2012|urlarchivo=https://web.archive.org/web/20120219085225/http://www.uimp.es/blogs/prensa/2011/08/11/expertos-en-cristalografia-lamentan-la-carencia-de-tecnicos-en-espana-y-apuestan-por-la-divulgacion-para-%e2%80%9cfomentar-las-vocaciones%e2%80%9d/|fechaarchivo=19 de febrero de 2012}}</ref><ref>{{cita libro|apellido=Fischer|nombre= R |apellido2=Hellmiss |nombre2= G |capítulo=Principles and forensic applications of X-ray diffraction and X-ray fluorescence|título= Advances in Forensic Sciences|volumen=2|editor= H. C. Lee y R. E. Gaensslen|editorial= Year Book Medical Publishers, Inc |ubicación= Chicago|año= 1989|páginas= 129-158|idioma=inglés |isbn=081515349X}}</ref>

=== Premios Nobel ===
[[Archivo:Insulincrystals.jpg|miniatura|Cristales de [[insulina]]. La cristalografía de proteínas ha contribuido notablemente al desarrollo de la biología molecular.]]
{{VT|Anexo:Ganadores del Premio Nobel de Química|Anexo:Ganadores del Premio Nobel de Física|l1=Ganadores del Premio Nobel de Química|l2=de Física}}
Varios de los descubrimientos y avances científicos que fueron llevados a cabo gracias a la cristalografía de rayos{{esd}}X han sidos galardonados con el [[Premio Nobel]].<ref>{{cita web|url=http://www.iucr.org/people/nobel-prize|título=Nobel Prize winners associated with crystallography|autor=IUcr|fechaacceso=13 de abril de 2012}}</ref> Entre ellos, una alta proporción se han otorgado a descubrimientos en [[química orgánica]] y biología; los primeros fueron los sendos premios en 1962 a [[John Kendrew|Kendrew]] y [[Max Perutz|Perutz]] en [[Premio Nobel de Química|Química]] y [[Francis Crick|Crick]], [[James Dewey Watson|Watson]] y [[Maurice Wilkins|Wilkins]] en [[Premio Nobel de Medicina|Medicina]], seguidos dos años más tarde por el galardón a [[Dorothy Hodgkin]]. Tras cuatro décadas de expansión, la cristalografía de macromoléculas empezó a contribuir de manera significativa al esclarecimiento de muchos procesos clave en la biología molecular y celular: En 1997, [[Paul D. Boyer|Boyer]], [[John E. Walker|Walker]] y [[Jens Skou|Skou]] recibieron el Nobel de Química por elucidar el mecanismo de la síntesis del [[Adenosín trifosfato|ATP]]; [[Roderick MacKinnon]] obtuvo dicho premio en 2003 por sus estudios de los [[canal iónico|canales de potasio]] en la [[membrana celular]] y [[Roger D. Kornberg|Roger Kornberg]] en 2006 por el análisis de la maquinaria de [[transcripción genética]]. En 2009, fue otorgado a [[Venkatraman Ramakrishnan|Ramakrishnan]], [[Thomas A. Steitz|Steitz]] y [[Ada Yonath|Yonath]] por el estudio de la estructura y función del [[ribosoma]], complejo celular que lleva a cabo la [[síntesis de proteínas]], y en 2012 a [[Robert Lefkowitz|Lefkowitz]] y [[Brian Kobilka|Kobilka]] por la investigación sobre los [[GPCR|receptores acoplados a proteínas G]], proteínas que permiten a las células detectar y responder a cambios en su entorno exterior.<ref name=nobels />

En el campo de la química inorgánica, la difracción con rayos{{esd}}X ha contribuido a la obtención de la estructura de los [[borano]]s, compuestos importantes para la síntesis química, por cuyo estudio la [[Real Academia de las Ciencias de Suecia|Academia]] recompensó a [[Herbert Charles Brown|Herbert Brown]] con el Nobel de Química en 1979. Asimismo, la técnica se ha usado para determinar la estructura de los [[fulereno]]s, materiales con interesantes propiedades físicas y químicas. En 1996, [[Harold Kroto|Krotro]], [[Richard Smalley|Smalley]] y [[Robert Curl|Curl]] recibieron el premio por el descubrimiento de estas moléculas.<ref name=nobels />

En otras ocasiones se ha concedido premios Nobel por desarrollos teóricos y prácticos de la técnica misma, reconociendo su impacto científico; en esta categoría se incluyen los premios en [[Premio Nobel de Física|Física]] a Max von Laue y William Henry y Lawrence Bragg, así como el de Química de 1936 a [[Peter Debye]] y el de 1985 para [[Herbert Aaron Hauptman|Hauptman]] y [[Jerome Karle|Karle]] por el desarrollo de los métodos directos para la solución de estructuras cristalinas.<ref name=nobels />

=== Análisis de minerales ===
La cristalografía de rayos{{esd}}X se utiliza no solo para obtener estructuras desconocidas, sino también para determinar la composición de muestras de suelos o minerales, así como para la identificación de metales y otros elementos. Cada sustancia mineral forma cristales con una celda unidad y simetría determinada, que resulta en un patrón de difracción característico. La difracción por el método de polvo es muy usada para este tipo de aplicaciones, por ser sencillo comparar el espaciado entre los anillos de difracción con los valores compilados por el ''Joint Committee on Powder Diffraction Standars'' (JCPDS).<ref name=ined-drx /> Las proporciones relativas de dos o más minerales presentes en una misma muestra se obtienen comparando las intensidades de sus respectivas líneas con aquellas de muestras de composición conocida. Un ejemplo de esta aplicación es la identificación de minerales arcillosos, la fracción del suelo cuyas partículas minerales tienen un tamaño inferior a 2{{esd}}[[Micrómetro (unidad de longitud)|μm]].<ref>{{cita libro|autor=Thorez, J. |título=Phyllosilicates and Clay Minerals. A Laboratory Handbook for Their X-Ray Diffraction Analysis|editorial=Lelotte|año=1975|idioma=inglés}}</ref><ref>{{cita libro|editorial=IGAC (Instituto Geográfico Agustín Codazzi)|título= Métodos Analíticos del Laboratorio de Suelos. Mineralogía de la Fracción Arcilla|edición= 6|ubicación=Colombia|año=2006|editor=Iván Darío Gómez Guzmán|isbn=9789589067987}}</ref>

El vehículo explorador [[Curiosity]], que aterrizó en [[Marte (planeta)|Marte]] en 2012 para estudiar la superficie del planeta, cuenta entre sus instrumentos científicos con un difractómetro compacto equipado con un generador de rayos{{esd}}X y un detector de área.<ref>{{cita web|url= http://drxp.info/2010/05/curiosity-drxp-en-marte/|apellido= Matesanz|nombre= Emilio|título= Curiosity:DRXP en Marte|fecha= 30 de mayo de 2010|fechaacceso= 14 de octubre de 2013|obra= DRXP en la práctica|urlarchivo= https://web.archive.org/web/20131219174726/http://drxp.info/2010/05/curiosity-drxp-en-marte/|fechaarchivo= 19 de diciembre de 2013}}</ref> En octubre de 2012, transmitió las primeras imágenes de difracción, que demostraron la presencia de minerales como [[feldespato]], [[piroxeno]] y [[olivina]] en el suelo marciano, mezclados con material amorfo, a semejanza de los terrenos basálticos de los volcanes de [[Hawái]].<ref>{{cita web |url=http://www.nasa.gov/home/hqnews/2012/oct/HQ_12-383_Curiosity_CheMin.html |apellido=Brown |nombre=Dwayne |título=NASA Rover's First Soil Studies Help Fingerprint Martian Minerals |fecha=30 de octubre de 2012 |editorial=[[NASA]] |fechaacceso=14 de octubre de 2013 |idioma=inglés |fechaarchivo=3 de junio de 2016 |urlarchivo=https://web.archive.org/web/20160603091908/http://www.nasa.gov/home/hqnews/2012/oct/HQ_12-383_Curiosity_CheMin.html |deadurl=yes }}</ref>

=== Diseño de fármacos ===
Desde finales de {{Siglo|XX||s}} se ha empezado a diseñar nuevos fármacos y medicamentos basados en [[Inhibidor enzimático|inhibidores]] y [[Sustrato (bioquímica)|sustratos]] naturales de diversas proteínas y enzimas involucradas en [[ciclo celular|ciclos celulares]] y [[metabolismo|metabólicos]]. El conocimiento de la estructura de la parte de la proteína —la forma y la distribución de cargas electrostáticas— que liga estos compuestos facilita este proceso, gracias a la mejor comprensión de las interacciones entre la proteína y el ligando de interés; esto permite concentrarse en el diseño de fármacos con las características específicas deseadas.<ref>{{cita publicación|título= Application of the Three-Dimensional Structures of Protein Target Molecules in Structure-Based Drug Design |nombre=Jonathan|apellido= Greer|nombre2= John W. |apellido2=Erickson,|nombre3=John J.|apellido3= Baldwin|nombre4=Michael D.|apellido4= Varney||publicación=Journal of Medicinal Chemistry|año=1994|volumen=37|número=8|páginas=1035–1054|doi=10.1021/jm00034a001|idioma=inglés}}</ref> Uno de los ejemplos más importantes de esta aplicación es el compuesto [[vemurafenib]], diseñado para bloquear una enzima mutante presente en el 60 % de los casos de [[melanoma]].<ref>{{cita publicación|título=Fragment-based Drug Discovery - From Hit Discovery to FDA Approval: Lessons Learned and Future Challenges|nombre=Terry V. |apellidos=Hughes|nombre2= Ian |apellidos2=Baldwin|nombre3= Ian |apellidos3=Churcher|publicación= International Drug Discovery|año=2011|url= http://www.biocompare.com/117128-b-Fragment-based-Drug-Discovery-From-Hit-Discovery-to-FDA-Approval-b-Lessons-Learned-and-Future-Challenges/ |urlarchivo=https://web.archive.org/web/20140509004202/http://www.biocompare.com/117128-b-Fragment-based-Drug-Discovery-From-Hit-Discovery-to-FDA-Approval-b-Lessons-Learned-and-Future-Challenges/|fechaarchivo=2014-05-09|idioma=en}}</ref>

== Comparación con otras técnicas de difracción ==
Debido a la [[dualidad onda-partícula]], es posible estudiar cristales mediante la difracción de un haz de [[neutron]]es o de [[electron]]es, además de con rayos{{esd}}X. Los primeros experimentos de difracción por electrones tuvieron lugar en 1926 y la difracción de neutrones se observó por vez primera en 1936. Aunque los experimentos y el análisis de datos obtenidos por cristalografía de electrones, neutrones y rayos{{esd}}X tienen mucho en común, existen algunas diferencias debidas a los diferentes modos de interacción con la materia: los electrones interaccionan tanto con el [[núcleo atómico]] como con los electrones que lo rodean y los factores de estructura cristalinos son unos cuatro órdenes de magnitud mayores que los resultantes de la dispersión elástica de rayos{{esd}}X, lo que posibilita el estudio de muestras de menor tamaño con electrones. Los neutrones, a su vez, son reflejados solo por el núcleo y no los electrones, aunque estos contribuyen indirectamente al factor de forma atómico mediante la creación de campos magnéticos; además, la interacción de la materia con ellos es mucho más débil que con los rayos{{esd}}X y es necesario usar [[reactor nuclear|reactores nucleares]] para generar haces de neutrones lo suficientemente intensos para obtener difracción cristalina.<ref>{{cita libro|url = http://www.iucr.org/__data/assets/pdf_file/0012/732/chap15.pdf |apellido= Ewald|nombre = Paul P.|capítulo= 15.7: Electron and Neutron Diffraction|páginas= 261-264| formato= PDF| editor= P.P. Ewald| título= Fifty Years of X-Ray Diffraction|edición= PDF|año= 1999|año-original = 1962|editorial = [[Unión Internacional de Cristalografía]]}}</ref>

Una ventaja importante del uso de electrones es que las fases pueden obtenerse a partir de la transformada Fourier de las imágenes del objeto en un microscopio electrónico. En 1968, [[David DeRosier]] y [[Aaron Klug]] publicaron un método para reconstruir mapas de densidad electrónica tridimensionales basados en este principio.<ref>{{cita publicación|apellido=DeRosier|nombre= D. J.|apellido2=Klug |nombre2= A.|publicación= Nature |volumen= 217|páginas= 130-134|título=Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs|año=1968|idioma=inglés}}</ref> Hasta la segunda década del {{siglo|XXI||s}}, la mejor resolución espacial de estos mapas —alrededor de 0,4{{esd}}[[nanometro|nm]]— era baja comparada con los valores alcanzables con rayos{{esd}}X o neutrones, aunque la [[criomicroscopía electrónica]] era útil en casos donde no era posible cristalizar la molécula a estudiar o la estructura no podía determinarse por otros métodos, principalmente en el ámbito de la biología macromolecular.<ref>{{cita libro|título= Electron Crystallography: Electron Microscopy and Electron Diffraction|serie=International Union of Crystallography Texts on Crystallography|volumen= 16|autor= Zhu, Xiaodong Zou; Hovmöller, Sven; Oleynikov, Peter|editorial= [[Oxford University Press]] |año= 2011| isbn=0199580200|página= 4|idioma=inglés}}</ref> El desarrollo de detectores directos de electrones y de técnicas computacionales para el [[Procesamiento digital de imágenes|procesamiento de imágenes]] han acercado la resolución de los mapas a la obtenida por cristalografía de rayos{{esd}}X.<ref>{{Cita publicación |url=https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S096800041400187X |título=How cryo-EM is revolutionizing structural biology |apellidos=Bai |nombre=Xiao-chen |apellidos2=McMullan |nombre2=Greg |fecha=2015-01 |publicación=Trends in Biochemical Sciences |volumen=40 |número=1 |páginas=49–57 |fechaacceso=2021-12-15 |idioma=en |doi=10.1016/j.tibs.2014.10.005 |apellidos3=Scheres |nombre3=Sjors H.W}}</ref> Las desventajas de la criomicroscopía electrónica residen en las dificultades de preparación de las muestras y el elevado coste del equipo necesario para obtener datos de alta calidad.<ref>{{Cita web |url=https://www.rsb.org.uk//biologist-features/focus-on-cryo-electron-microscopy |título=Focus on: Cryo-electron microscopy |fechaacceso=2021-12-15 |sitioweb=RSB |urlarchivo=https://web.archive.org/web/20211215152258/https://www.rsb.org.uk//biologist-features/focus-on-cryo-electron-microscopy|fechaarchivo=2021-12-15|idioma=en}}</ref>

En lo que respecta a la cristalografía de neutrones, la ventaja principal estriba en la clara visualización de los átomos de hidrógeno, muy difíciles de detectar con rayos X debido a que solo poseen un electrón; esta propiedad constituye una ventaja para el estudio de aquellas moléculas orgánicas en cuya función tenga un papel importante el intercambio de hidrógeno.<ref>{{cita publicación|título=Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations|nombre=Matthew P |apellido=Blakeley |nombre2= Paul|apellido2= Langan |nombre3=Nobuo | apellido3=Niimura | nombre4=Alberto |apellido4=Podjarny|publicación = Current Opinion in Structural Biology|año= 2008 |volumen=18 |número=5 |páginas= 593–600| doi= 10.1016/j.sbi.2008.06.009 |idioma=inglés}}</ref> Además, los neutrones no ionizan los átomos, por lo que no destruyen los enlaces moleculares durante el experimento.

== Limitaciones ==
La limitación fundamental de la cristalografía de rayos{{esd}}X consiste en que solo puede aplicarse a sustancias susceptibles de formar cristales. Aunque las técnicas cristalográficas pueden utilizarse también para determinar la estructura de otros materiales con periodicidad espacial, como fibras [[Hélice (geometría)|helicoidales]] —ADN, algunos tipos de virus, etc.— y [[cuasicristal]]es, resulta imposible estudiar gases, líquidos y sólidos desordenados por este método. Además, la obtención de cristales no es siempre suficiente para obtener la estructura de interés: las moléculas de tamaño grande, por ejemplo, suelen ser casos difíciles.<ref name=cms /> 
[[Archivo:Cambios en los mapas de densidad.jpg|miniatura|Efectos de los rayos{{esd}}X en un [[enlace disulfuro]]: los átomos de [[azufre]] (en naranja) capturan los [[fotoelectron]]es emitidos por los átomos presentes en la molécula al ser excitados por los rayos{{esd}}X. Al [[reducción-oxidación|reducirse]], el enlace entre ellos se rompe y se desplazan de su posición original, como indica la desaparición gradual de la densidad electrónica a su alrededor. Esto resulta en un modelo erróneo de la estructura.]]
Otro límite de la técnica está relacionado con el tipo de información que proporciona sobre la estructura: Los modelos obtenidos por difracción representan una media de las posiciones atómicas para todas las moléculas del cristal; cuando la molécula cuenta con átomos que oscilan entre diferentes conformaciones, la densidad electrónica media se extiende sobre la totalidad del espacio que pueden ocupar estos átomos y las partes desordenadas de la molécula resultan invisibles. Esto representa un serio problema para el estudio de [[enzima]]s si el [[sitio activo]] de la molécula —asociada a su actividad química— presenta una gran movilidad; en este caso la determinación de las propiedades de materiales biológicos ''in vivo'' a partir de su estructura cristalina es problemática y requiere métodos de estudio alternativos, como la [[resonancia magnética nuclear]].

Las vibraciones atómicas también limitan la resolución alcanzable con los datos de difracción, incluso cuando las moléculas adoptan la misma conformación en distintas celdas unidad. La resolución del modelo no suele ser suficiente para determinar el estado de oxidación, posicionar todos los átomos de hidrógeno o distinguir elementos con números atómicos semejantes.<ref name=cms>{{Cita web|url=http://cms.uga.edu/XCry.html|urlarchivo=https://web.archive.org/web/20121030090949/http://cms.uga.edu/XCry.html|fechaarchivo=30 de octubre de 2012|título=X-Ray Crystallography|autor=Center for Metalloenzyme studies|fechaacceso=19 de marzo de 2012|idioma=inglés}}</ref><ref>{{Cita web|url=http://www.cryst.bbk.ac.uk/pps97/assignments/projects/ambrus/html.htm|autor=Ambrus, Attila|título=Comparison of NMR and X-Ray Crystallography as Methods of the Protein Structure Determination|fechaacceso=19 de marzo de 2012|idioma=inglés}}</ref> La débil interacción de los rayos X con los átomos ligeros es otra desventaja de la técnica en aplicaciones, como la caracterización de nanomateriales.<ref>{{Cita web|url=http://www.gitam.edu/eresource/nano/NANOTECHNOLOGY/tem.htm|título=Special nano materials, characterization and Tools|autor=Suneel, Sri D.|fechaacceso=19 de marzo de 2012|idioma=inglés|urlarchivo=https://web.archive.org/web/20120402222028/http://www.gitam.edu/eresource/nano/nanotechnology/tem.htm|fechaarchivo=2 de abril de 2012}}</ref>

Finalmente, las propiedades [[ionización|ionizantes]] de los rayos{{esd}}X pueden alterar o destruir las moléculas del cristal durante el experimento. Cuando esto ocurre, el modelo obtenido no refleja la verdadera estructura molecular y puede dar lugar a interpretaciones erróneas sobre sus propiedades. Además, las distorsiones globales de la red cristalina y otros efectos secundarios de la irradiación dificultan la obtención de las fases. Este problema es grave en cristales de proteínas, que contienen una alta proporción de agua y compuestos orgánicos fácilmente [[radiobiología|radiolizables]], y un gran número de [[enlace químico|enlaces químicos]] susceptibles al ataque por los [[radicales libres]] y electrones producidos por dicha radiolisis. Los experimentos con moléculas biológicas se suelen realizar a temperaturas de {{nowrap|100 K}} o menores; esto frena la difusión de los radicales libres, aunque no soluciona enteramente el problema, pues los [[fotoelectron]]es excitados por los rayos{{esd}}X permanecen móviles hasta el [[cero absoluto]].<ref>{{cita publicación|apellidos=Garman |nombre= Elspeth F. |año=2010|título= Radiation damage in macromolecular crystallography: what is it and why should we care? |publicación=Acta Crystallographica D|volumen=66 |páginas= 339-351|idioma=inglés|doi=10.1107/S0907444910008656}}</ref><ref>{{cita publicación|apellidos=Garman |nombre= Elspeth F. |año=2003|título='Cool' crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage |publicación=Current Opinion in Structural Biology| volumen= 13|número= 5 |páginas= 545-551|pmid=14568608 |doi=10.1016/j.sbi.2003.09.013}}</ref> Los cortos pulsos (alrededor de 10 fs) de los láseres de electrones libres de rayos{{esd}}X permiten obtener patrones de difracción por cristalografía en serie antes de que los procesos de ionización alteren la estructura de las moléculas. La técnica de cristalografía en serie también puede aplicarse en las líneas de luz de los sincrotrones más modernos; mientras que en un sincrotrón los pulsos de radiación son demasiado largos para impedir los efectos de la irradiación, estos son menores que en experimentos convencionales y el coste del experimento es menor que en un láser de electrones libres.<ref name="bioscirep17" />

== Véase también ==
* [[Cristalografía]]
* [[Difracción de electrones]]
* [[Difracción de neutrones]]
* [[Espectroscopia de rayos X]]
* [[Resonancia magnética nuclear]]

== Notas ==
{{listaref|group=n.}}

== Referencias ==
{{listaref|2}}

=== Bibliografía ===
* {{cita libro|título=Crystal structures of clay minerals and their X-ray identification|editor=Brindley, George W. y Brown, George|editorial=Mineralogical Society|año = 1980|isbn=0903056089|idioma=inglés}}
* {{cita libro|título= Principles of protein x-ray crystallography|url= https://archive.org/details/principlesofprot0002dren| nombre=Jan|apellidos=Drenth|edición = 2ª|editorial=Springer |año = 1999|isbn= 0387985875|idioma=inglés}}
* {{cita libro|apellidos=Helliwell|nombre=John R.|título=Macromolecular crystallography with synchrotron radiation|año=1992|editorial=[[Cambridge University Press]]|isbn=0-521-33467-5|idioma=inglés}}
* {{cita libro|apellidos=Luger|nombre=Peter|título=Modern x-ray analysis on single crystals |año=1980|editorial=Walter de Gruyter|isbn=3-11-006830-3 |idioma=inglés}}
* {{cita libro|apellidos=Stout|nombre=George H.|apellidos2=Jensen|nombre2=Lyle H.|título=X-ray structure determination — A practical guide|url=https://archive.org/details/xraystructuredet0000stou|edición=2ª|editorial=John Wiley & sons|isbn=0-471-60711-8 |año=1989|idioma=inglés}}

== Enlaces externos ==
*[https://www.xtal.iqf.csic.es/Cristalografia/ Portal de Cristalografía del Consejo Superior de Investigaciones Científicas de España]
*[http://www.iucr.org Unión Internacional de Cristalografía] {{en}}

{{Control de autoridades|commons=[[:Commons:Category:X-ray diffraction|Difracción de rayos X]]}}

[[Categoría:Cristalografía]]
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